微生物遗传实验

微生物遗传实验第1页/共37页微生物遗传实验第2页/共37页实验一微生物的诱发突变第3页/共37页实验二抗药性突变株的分离第4页/共37页实验三大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化、筛选第5页/共37页1.实验目的和要求通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。第6页/共37页2.相关知识及原理感受态细胞(Competentcells):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competentcell)。

第7页/共37页转化（transformation）：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。第8页/共37页转化的方法：化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。第9页/共37页克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；第10页/共37页将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。第11页/共37页重组质粒克隆的鉴定鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合-互补现象来筛选。第12页/共37页-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（-互补）。当这种载体转入可编码－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基--D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为-互补现象。第13页/共37页由互补产生的－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。第14页/共37页第15页/共37页重组DNA转化细菌过程示意图第16页/共37页3．仪器、材料和试剂无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等；菌株：E.coliDH5α质粒：pMD19-T+DNA

片段的质粒以及pMD19-T空质粒；LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度50-100µg／mL，X-gal20-48µg/ml,IPTG100µg/ml。一般将抗生素、X-gal和IPTG配制成1000储备液，用时按培养基的量再加入）；预冷CaCl2溶液（0.1mol／L）第17页/共37页4．操作步骤

1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)（1）从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5mlLB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:100～1:50转接于100mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；第18页/共37页（2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上冷却20-30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；（3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；第19页/共37页（4）0～4℃，4000r／min离心10min；（5）弃去上清液，加入500µl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，4000r／min离心10min；（6）弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；（7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。第20页/共37页2）细胞转化

(1)分别取3个100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第一组，加入1µl重组质粒DNA(体积不超过10µl)+100µl感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，质粒DNA对照组1µl+100µl感受态细胞悬液。第21页/共37页(2)将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温60－90S，然后迅速冰上冷却2min(3)立即向上述管中分别加入0.4mlLB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养约30min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。第22页/共37页3)平板培养（有时需要稀释）取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。第23页/共37页(2)菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。用CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。第24页/共37页4)检出转化体和计算转化率统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况应如表所示:

第25页/共37页组含抗菌素的平板结果说明

转化实验组白色菌落和少量蓝色菌落说明有重组质粒导入细胞中（有时还需要酶切进一步鉴定〕插入DNA片段对照组无菌落感受态无污染

质粒对照组蓝色菌落可以判断感受态细胞的效率各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析第26页/共37页转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）转化频率＝转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数）第27页/共37页实验四细菌的三亲接合实验目的要求1、了解细菌接合导致遗传重组的基本原理2、学习细菌三亲接合实验的基本方法第28页/共37页基本原理细菌接合是指供体菌和受体菌完整细胞直接接合时供体菌向受体菌单向传递而导致基因重组的现象。供体菌：大肠杆菌DH5α（带有可移动的抗性质粒，有转移起始位点，但没有自主转移基因）辅助菌：E.coliHB101（带有自主转移的抗性质粒，编码诱动基因、转移基因）受体菌：P.putida（本身没有质粒，染色体上有氯霉素抗性基因）转移，但不能自我复制，被稀释转移，且能自我复制第29页/共37页2.F因子及其在杂交中的行为(pp160-163)第30页/共37页第31页/共37页实验器材菌株和质粒辅助菌：E.coliHB101（pRK2013/mob+，tra+，Kmr，大小为25Kb左右，辅助质粒，可自主转移），卡那霉素使用浓度为50ppm（母液浓度为50000ppm，用无菌水配）供体菌：E.coliDH5α（pBBR1MCS-5/mob+，tra-，Gmr，大小为4.7Kb左右，可移动质粒），庆大霉素使用浓度为40ppm（母液浓度为40000ppm，用无菌水配）受体菌：Pseudomonasputida(Cmr)，（菌株本身没有质粒、染色体上带有氯霉素抗性基因），氯霉素使用浓度为40ppm（母液浓度为40000ppm，用甲醇配）第32页/共37页实验器材培养基

LB培养基、添加相应抗生素的LB固体培养基和液体培养基溶液或试剂

卡那霉素、庆大霉素、氯霉素、甲醇仪器或其他用具

5ml离心管、灭菌镊子、细菌滤膜（灭菌）（0.25μm）、移液器、涂布棒第33页/共37页实验步骤1、分别在加有相应抗生素的LB培养基中培养供体菌、辅助菌、手提菌至对数中期（一般10~12h）（pseudomonasputida于30℃培养，E.coliHB101和E.coliDH5α于37℃培养）第34页/共37页实验步骤2、将三种菌液各取1mL至同一离心管中，5000rpm，5min离心收集菌体，无菌水洗涤两次（为了洗去抗生素），去上清，离心管倒扣至吸水纸上将残留液体去除干净。

3、加50μl的无菌水重新悬浮菌体第35页/共37页实验步骤4、用灭过菌的镊子取一张灭过菌的细菌滤膜放于