基因操作的主要技术原理

基因操作的主要技术原理第1页，共109页，2023年，2月20日，星期四第一节核酸的分离与纯化核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的方式存在的真核生物95%DNA存在于细胞核内，5%在细胞器75%的RNA存在于细胞质，10%在核内，15%在细胞器rRNA（80～85%），tRNA及核内小分子RNA（10～15%），mRNA（1～5%）第2页，共109页，2023年，2月20日，星期四一、核酸分离提取的原则1.保证核酸一级结构的完整性

2.排除其它分子的污染

核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子将其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降到最低排除其它核酸分子的污染

第3页，共109页，2023年，2月20日，星期四核酸提取的基本要求

尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏

减少化学因素对核酸的降解（过酸、过碱）

减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力、高温）

防止核酸的生物降解

第4页，共109页，2023年，2月20日，星期四提取核酸的一般程序:

破碎细胞去除与核酸结合的蛋白质及多糖等去除其它核酸分子沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质纯化核酸核酸的质量评估（电泳、D260/OD280，酶切）第5页，共109页，2023年，2月20日，星期四二、质粒载体的分离与纯化

关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开依据：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA提取过程中，染色体DNA断裂成片段(线状)，而质粒DNA仍保持超螺旋构型第6页，共109页，2023年，2月20日，星期四变性法提取质粒DNA的原理

在变性条件（碱性或高温)下，线状染色体DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢复天然构型，染色体DNA难以复性，交联形成不溶性网状结构，与变性的蛋白质和RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于上清液中。第7页，共109页，2023年，2月20日，星期四碱变性法提取质粒DNA的步骤收集细胞沉淀加入溶液I(50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mMEDTA,4~5mg/mL溶菌酶）加入溶液II(0.2MNaOH,1%SDS)加入溶液III(3MNaAcpH4.8)离心除去沉淀，得含质粒DNA的上清液苯酚抽提去除蛋白质乙醇沉淀收集质粒DNA在强碱性环境中暴露时间过长，cccDNA可发生不可逆变性第8页，共109页，2023年，2月20日，星期四关键：尽可能地保持其高分子量细菌

3300~4200kb酵母

15,000kb果蝇

1.65x105kb人

3x106kb植物

2x105~1x108kb天花病毒

288kb痘病毒

196kb三、染色体DNA的分离纯化第9页，共109页，2023年，2月20日，星期四CsCl密度梯度离心原理：CsCl介质密度为1.7g/cm3，超速离心后形成1～1.9052g/cm3的密度梯度EB（溴化乙锭）可嵌入DNA两条链的碱基对之间，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应第10页，共109页，2023年，2月20日，星期四线性或开环DNA分子，因其具有游离的末端而易于解旋，故可结合相当大量的EB直到达到饱和具有ccc结构的质粒DNA由于负超螺旋的存在阻止DNA解链，因而只能结合很少的EBDNA分子中结合EB越多，其浮力密度越小，因而形成不同的浮力密度得以区分

第11页，共109页，2023年，2月20日，星期四质粒质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第12页，共109页，2023年，2月20日，星期四

关键：防止内外源RNase的作用

四、RNA的分离与纯化第13页，共109页，2023年，2月20日，星期四RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围抗高温严寒(0~65℃均具活性，100℃也不能使之完全失活）抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性）酶活性不需要辅助因子存在范围广

第14页，共109页，2023年，2月20日，星期四解决办法：外源RNase：高温（干热180℃，4hrs），焦碳酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套

内源RNase：高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等第15页，共109页，2023年，2月20日，星期四五、核酸的浓缩与贮存

沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其最大的优点是通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调节核酸在溶液中的浓度，可去除溶液中某些可溶性的盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸沉淀DNA的最常用方法是在DNA溶液中加入1/10体积的3MNaAc（或KAc）和2倍体积的乙醇，放置15～30min，离心收集DNA沉淀，倒去上清液，加入70%的乙醇洗涤沉淀，去除残余的盐，再离心收集沉淀。第16页，共109页，2023年，2月20日，星期四

贮存DNA：溶于TE中，放置于4℃、-20℃、-70℃RNA：溶于0.3MNaAc(pH5.2)或ddH2O中，-70℃

长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇中，-20℃第17页，共109页，2023年，2月20日，星期四六、核酸的质量评估方法

核酸浓度的测定

ds-DNA：1OD260≈50μg/ml

ss-DNA&RNA：1OD260≈40μg/ml

单链寡核苷酸：1OD260≈20μg/ml

第18页，共109页，2023年，2月20日，星期四核酸纯度的测定

DNA：A260/A280=1.8

若＞1.8，说明RNA未除尽＜1.6，蛋白质或酚未除尽RNA：A260/A280=2.0

＜2.0，蛋白质或酚未除尽第19页，共109页，2023年，2月20日，星期四第二节凝胶电泳一、核酸电泳的基本原理

核酸分子中的磷酸基团带负电荷，在电场中将向正极移动，通过凝胶的分子筛作用可以将不同大小和构型的核酸分子分离，分子量小的DNA，具有较紧密的构型，在凝胶中移动快；反之，分子量大的DNA移动慢

第20页，共109页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力

凝胶类型及浓度分辨DNA片段的大小范围（bp）

0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1

DNARNADNA蛋白质第21页，共109页，2023年，2月20日，星期四核酸电泳的染色剂和指示剂

指示剂

在电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程

琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%溴酚蓝1kb0.6kb0.2kb0.15kb二甲苯青蓝2kb1.6kb

第22页，共109页，2023年，2月20日，星期四染色剂

溴化乙锭（EB）：嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外光下呈现橙色荧光由于单链DNA、RNA中常存在自身配对的双链区，也可嵌入EB分子

EB是一种诱变剂，见光易分解第23页，共109页，2023年，2月20日，星期四在常规电泳中，DNA移动距离与分子量有关：分子量小的移动快，反之则慢大于20kb的DNA大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些DNA分子要通过胶孔时必须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消失了。

三、脉冲场凝胶电泳第24页，共109页，2023年，2月20日，星期四

在脉冲场凝胶电泳中，加在凝胶上至少有两个电场方向，使得DNA分子要不断地调整泳动方向，不同分子量大小的DNA分子用于改变泳动方向的时间不同，则可以得到分离脉冲场凝胶电泳

Pulsed-FieldGelElectrophoresis，PFGE

第25页，共109页，2023年，2月20日，星期四

PFGE工作原理DNA松弛时间：大分子DNA改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与DNA分子量呈正相关（Tr）

DNA移动时间：DNA分子向前移动的时间（Tm）

电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（Tp）

第26页，共109页，2023年，2月20日，星期四分子量大的DNA分子所需的松弛时间长，分子量小的则短。由于脉冲时间是一个人为的固定值，那么用于向前移动的时间则随分子量大小而变化。分子量大的用于向前运动的时间少，移动距离就短，分子量小的用于向前运动的时间多，移动距离就长。第27页，共109页，2023年，2月20日，星期四Tp小

=Tm小+Tr小

Tp大

=Tm大+Tr大

Tp小

=Tp大

Tr小<Tp小

，故

Tm小

>Tm大

，所以，

S小>S大

显然，要使一个DNA样品中不同大小的DNA分子分离，脉冲时间应选在最大DNA分子所需的上限。

第28页，共109页，2023年，2月20日，星期四第三节DNA序列分析

1.双脱氧核苷酸链终止法

Dideoxy-terminationsequencing

Sanger法第29页，共109页，2023年，2月20日，星期四第30页，共109页，2023年，2月20日，星期四基本原理：

双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’

端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列第31页，共109页，2023年，2月20日，星期四过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影

第32页，共109页，2023年，2月20日，星期四DNASequencingReactionsTheDNAsequencingrunissimilartothePCRrun.TherunmixincludesthetemplateDNA,Taqpolymerase,dNTPs,ddNTPs,andaprimer:asmallpieceofsingle-strandedDNA20-30ntlongthathybridizestoonestrandofthetemplateDNA.TherunisintitiatedbyheatinguntilthetwostrandsofDNAseparate,thentheprimersannealstothecomplementarytemplatestrand,andDNApolymeraseelongatestheprimer.第33页，共109页，2023年，2月20日，星期四4differentDNAsynthesisreactionsarerunbeginsynthesisfromspecificprimingpointaddcomponentsforDNAsynthesis+specificddNTPforeachofthefourreactions…e.g.ddATPNo3’OH...第34页，共109页，2023年，2月20日，星期四ddCTPACCCTTGG第35页，共109页，2023年，2月20日，星期四MethodfromSaenger

ManualsequencingusesradiolabeleddATP(35-Sor33-P)tolabeltheDNA.

Thesampleisthensplitintofourtubes

eachwithanindividualddNTPpresent.

Thesamplesarethensubjectedtoacrylamidegelelectrophoresisfollowedbyautoradiography.第36页，共109页，2023年，2月20日，星期四DNA全自动测序第37页，共109页，2023年，2月20日，星期四PuttingItAllTogetherUsinggelelectrophoresistoseparateeachDNAfragmentthatdiffersbyasinglenucleotidewillbandeachfluorescentlytaggedterminatingddNTPproducingasequencingread.Thegelisreadfromthebottomup,from5’to3’,fromsmallesttolargestDNAfragment.第38页，共109页，2023年，2月20日，星期四

屏幕显示的胶图第39页，共109页，2023年，2月20日，星期四RawAutomatedSequencingDataA5laneexampleofrawautomatedsequencingdata. Green: ddATP Red: ddTTP Yellow: ddGTP Blue: ddCTP第40页，共109页，2023年，2月20日，星期四Sanger：荧光检测第41页，共109页，2023年，2月20日，星期四

377测序仪人类基因组计划测序的主力机型测序的主要设备第42页，共109页，2023年，2月20日，星期四上样走电泳编写样品清单第43页，共109页，2023年，2月20日，星期四全自动的测序仪器：MegaBace第44页，共109页，2023年，2月20日，星期四

华大基因研究中心(北京)

承担了人类3号染色体短臂上的约3000万对碱基的测序任务，使中国成为继美、英、日、德、法之后第六个加入"国际测序俱乐部"的国家。中心已建成了基因组学、蛋白质组学、生物信息学研究及产业化平台，拥有ABI377-96平板测序仪11台，MegaBACE1000毛细管测序仪70台。

第45页，共109页，2023年，2月20日，星期四TADA!!2001

TheHGPconsortiumpublishesitsworkingdraftinNature(15February),andCelerapublishesitsdraftinScience(16February).第46页，共109页，2023年，2月20日，星期四2.Maxam-Gilbert化学法

原理：DNA链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应，然后发生1~2个碱基的脱落或取代，最后发生链断裂，不同位置断裂的DNA分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列

第47页，共109页，2023年，2月20日，星期四4种反应体系中，化学试剂特异断裂DNA机制G反应：硫酸二甲脂使鸟嘌呤N7甲基化A＋G反应：甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，使嘌呤环被吡啶取代C+T反应：肼能裂解嘧啶环，进而导致其脱落C反应：在一定浓度的NaCl条件下，肼只对胞嘧啶起作用第48页，共109页，2023年，2月20日，星期四第49页，共109页，2023年，2月20日，星期四第50页，共109页，2023年，2月20日，星期四第51页，共109页，2023年，2月20日，星期四化学法测序的一大优点是不需要模板，引物和DNA聚合酶。待测DNA链的检测用32P末端标记

第52页，共109页，2023年，2月20日，星期四作业Asolutioncontainsdouble-strandedDNAfragmentsofsize3kb,6kb,9kb,and12kb.Theyareseparatedinanelectrophoresisgel.Inthediagramofthegelattheright,matchthefragmentsizeswiththecorrectbands.第53页，共109页，2023年，2月20日，星期四

AclonedfragmentofDNAwassequencedbyusingthedideoxymethod.ApartoftheautoradiogramofthesequencinggelisrepresentedhereDeducethenucleotidesequenceoftheDNAnucleotidechainsynthesizedfromtheprimer.Labelthe5′and3′endsDeducethenucleotidesequenceoftheDNAnucleotidechainusedasthetemplatestrand.Labelthe5′and3′endsWritethenucleotidesequenceoftheDNAdoublehelix(labelthe5′and3′ends)第54页，共109页，2023年，2月20日，星期四第四节

分子杂交技术第55页，共109页，2023年，2月20日，星期四核酸杂交Southern印迹杂交（Southernblotting）Northern印迹杂交（Northernblotting）Western印迹杂交（Westernblotting

）第56页，共109页，2023年，2月20日，星期四

Southern杂交

Southern杂交是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术，用于特定DNA序列的检测，包括基因组特定DNA序列的定位，相关片段的同源性测定、从cDNA库、基因组文库中筛选目的基因等。用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。第57页，共109页，2023年，2月20日，星期四Southern印迹杂交的用途确定在克隆片段中基因编码区的大小和位置确定克隆片段在基因组中的拷贝数第58页，共109页，2023年，2月20日，星期四Southernblotting第59页，共109页，2023年，2月20日，星期四Southernblotting第60页，共109页，2023年，2月20日，星期四第61页，共109页，2023年，2月20日，星期四第62页，共109页，2023年，2月20日，星期四NorthernBlotting相对Southernblotting命名的，与Southernblotting不同的是，它检测的对象是RNA分子。

第63页，共109页，2023年，2月20日，星期四第64页，共109页，2023年，2月20日，星期四第65页，共109页，2023年，2月20日，星期四WesternBlotting杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从SDS中转移到一固相支持物上，通过与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反应进行检测

主要用于基因的表达产物蛋白质的检测第66页，共109页，2023年，2月20日，星期四第67页，共109页，2023年，2月20日，星期四第68页，共109页，2023年，2月20日，星期四

第五节PCR技术第69页，共109页，2023年，2月20日，星期四一、PCR技术的基本原理

Polymerasechainreaction,PCR

聚合酶链式反应

AmethodforamplifyingspecificDNAsegmentsthatexploitscertainfeaturesofDNAreplication.第70页，共109页，2023年，2月20日，星期四一个DNA经n次扩增后,一个DNA分子可变为2n

理论上经过30次循环，靶DNA得到109倍的扩增，实际是106~7倍的扩增DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物第71页，共109页，2023年，2月20日，星期四二、PCR反应的各种组份及作用

第72页，共109页，2023年，2月20日，星期四一个标准的PCR反应体系（50~100μl）

50mmol/LKCl10mmol/LTris-HCl（pH=8.4）

1.5mmol/LMgCl2100μg/ml明胶或牛血清白蛋白（BSA）

2个引物，各0.25μmol/LdNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP）各200μmol/L

模板DNA（人基因组DNA）0.1~1μgTaqDNA聚合酶2U第73页，共109页，2023年，2月20日，星期四Denaturation94℃,0.5minPrimerannealing55℃,1.5mionExtension72℃,1min30cycles

变性（模板）－退火（引物与模板）－延伸（新合成DNA链）第74页，共109页，2023年，2月20日，星期四1.模板DNA用于PCR扩增的模板DNA通常是从细胞中提取的染色体DNA，它们并不需要高度纯化。待扩增的靶DNA的长度在3kb以下是PCR的有效扩增范围，采用经改造的TaqDNA聚合酶可扩增出40kb的DNA片段。

第75页，共109页，2023年，2月20日，星期四2.引物PCR引物是与待扩增的目的DNA两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段引物的长度通常为17~30个核苷酸

引物太短，可能同非靶DNA杂交，得出非预期的扩增产物；引物太长，引物与模板的结合效率降低，影响扩增效率。

第76页，共109页，2023年，2月20日，星期四如8nt的引物，平均每48=65536bp就会有一个结合位点，在全长为3×109bp的人类基因组中，大约有43000个可能的结合位点，不能得到单一的特异性扩增产物。如为17nt的引物，出现几率为417=17,179,869,184bp，长度超过人类基因组长度的5倍，故在人类基因组中只可能有一个结合位点。但引物不是越长越好，过长的引物同模板DNA的杂交效率反而下降，从而降低PCR反应的效率。第77页，共109页，2023年，2月20日，星期四简并引物

是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间只有一个或数个核苷酸的差异。如根据氨基酸序列推测出的核苷酸序列。第78页，共109页，2023年，2月20日，星期四引物与复性温度

引物与模板结合的特异性与复性温度有密切关系当复性温度偏低时，引物与模板配对出现错配碱基，导致一些不需要的DNA片段被扩增复性温度过高，引物与模板不能配对复性温度常与引物的长度和碱基组成有直接关系，引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些

Tm=4×(G＋C)＋2×(A＋T)℃1~2℃below第79页，共109页，2023年，2月20日，星期四引物设计的一般原则:

Correspondwiththesequencesflankingthetargetregiononthetemplatemolecule.

第80页，共109页，2023年，2月20日，星期四引物的长度常为17~30GC含量为40%~60%Tm值高于55℃两条引物间配对碱基数小于5个引物自身配对(特别是在引物的3’端)形成的茎环结构,茎的碱基配对数不大于3

通常采用计算机辅助设计第81页，共109页，2023年，2月20日，星期四3.dNTP

浓度为20~200μmol/L，4种dNTP以等摩尔浓度配制浓度过高，加快反应速度，但可增加碱基的错误掺入率和成本浓度过低，反应速度下降，提高实验的精确性第82页，共109页，2023年，2月20日，星期四4.TaqDNA聚合酶

基本特点:TaqDNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得具有DNA聚合酶活性、5’→3’外切酶活性、逆转录酶活性最适反应温度为80℃最适pH8.0和最佳反缓冲液Tris·HCl最佳二价阳离子Mg2+

（10mM）具良好的热稳定性：在90℃下连续反应30分钟仍有70%的酶活第83页，共109页，2023年，2月20日，星期四

扩增产物的可靠性:评估DNA聚合酶的一个重要指标是它复制DNA的可靠性，即掺入错误碱基的频率天然复制的DNA分子中错误掺入率为10-9在体外实验中，Klenow片段的错误掺入率为10-4，TaqDNA聚合酶的错误掺入率为5×10-3

，而T4聚合酶的错误掺入率为10-7在克隆基因时，应采用高保真的TaqDNA聚合酶（Pfu）（3’-5’exonuclease)

第84页，共109页，2023年，2月20日，星期四5.PCR反应的平台期

反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，出现平台期的原因可能有：①后期循环酶浓度或聚合时间不足；②引物耗尽；③dNTP耗尽；④产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。第85页，共109页，2023年，2月20日，星期四三、PCR产物的鉴定GelelectrophoresisofPCRproductsCloningofPCRproductsSequencingofPCRproducts第86页，共109页，2023年，2月20日，星期四CloningPCRproductsTaqDNApolymerasetendstoaddanadditionalnucleotide,usuallyA,totheendofeachstranditsynthesizes.第87页，共109页，2023年，2月20日，星期四Designprimersthatcontainrestrictionsites第88页，共109页，2023年，2月20日，星期四第六节DNA芯片技术第89页，共109页，2023年，2月20日，星期四DNA芯片或微阵列技术

(DNAchipormicroarray)DNA芯片（或基因芯片）是将许多特定的DNA寡核苷酸或DNA片段（称为探针）固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交分析，利用碱基互补配对原理进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面第90页，共109页，2023年，2月20日，星期四基因芯片第91页，共109页，2023年，2月20日，星期四基因芯片是基因功能研究领域的一次革命

与其他的基因检测技术相比，基因芯片技术最大的特征在于能同时定量或定性地检测成千上万的基因信息基因芯片技术具有微型化、自动化和网络化等特点，是典型的多学科高技术交叉的结晶第92页，共109页，2023年，2月20日，星期四1991年世界第一块原位合成寡核苷酸芯片在美国Affymetrix诞生1995年世界第一块cDNA芯片在斯坦福大学实验室诞生

--Science.1995,270:467-470基因芯片的历史80年代末期科学家提出杂交法测序的思想，也就是寡核苷酸芯片的基本原理第93页，共109页，2023年，2月20日，星期四基因芯片技术流程

制备方法及点样仪器探针的制备：标记方法杂交：杂交液、杂交温度、洗涤条件的选择

扫描仪:激光

CCD分析软件的开发基因芯片的制备杂交检测