常规病毒学实验技术

常规病毒学实验技术(一)病毒的培养①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系，(用实验动物作中和试验和交叉保护实验)④制备免疫血清和单克隆抗体⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。(一)条件要求(二)优点组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。(三)接种途径1．绒毛尿囊膜接种(10-12日龄鸡胚)主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。1)方法一(造人工气室)①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。③在气室端中央钻一个小孔。④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。2)方法二①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。③滴入接种物。④用透明胶纸封闭开口。2．尿囊腔接种(10-11日龄)用于正粘病毒和副粘病毒(NDV)1)画出气室和胚位2)在气室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3)用钢锥穿一小孔4)将注射器针头沿此小孔插入0.5-1cm，注入接种物5)用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种(6-8日龄)主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。1)画出气室和胚位2)垂直放置在卵座上，用碘酊和酒精消毒气室外端3)以钢锥在气室中央锥一小孔4)将注射器针头沿此小孔插入3cm，注入接种物5)用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次4．其它接种途径羊膜腔接种，正粘病毒和副粘病毒静脉接种，蓝舌病毒脑内接种，狂犬病毒原代细胞：应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，贴附于玻璃壁上，并生长增殖。继代细胞：将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细胞，这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。原代细胞培养(以鸡胚成纤维细胞为例)1)在无菌条件下采取9-10日龄鸡胚，置灭菌平皿中，除去头(或仅除去喙和眼)、爪和内脏，并剪成块。2)用Hanks液，充分冲洗后移入大号青霉素瓶或其它广口瓶中，用眼科剪剪成3)加入Hanks液，充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，使细胞游离。吸弃上清液，按每个鸡胚5ml的量，加入营养液，并用吸管反复吹打，直至形成均匀的细胞悬液。7)细胞计数(培养时，使细胞达到5×105个/ml)取细胞悬液0.5ml+2ml0.1%结晶紫——构椽酸(0.1mol/L)溶液，室温或。按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数(N)。每ml悬液中的细胞数(n)=N/4×10000×K(稀释倍数)。传代细胞系培养2)不少细胞系对病毒很敏感。3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。4)生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。细胞分散剂1．胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。营养液1．人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。2．血清1)动物血清中含有细胞生长所必须的各种营养因子。2)促进细胞的贴壁和生长。3)具有很强的酸碱缓冲作用。(二)病毒感染力的滴定LD，EID，TCID 502．将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种3．然后在每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3×105个/ml。4．设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。果，一般需要观察5-7天。TCID的计算方法：501．Reed-Muench法00孔所占(27/27)(19/19)不出现CPE孔00病毒液稀释度10-18891.6(11/91.6(11/140(4/10)0.7(1/13)0(0/21)164105830高于50%的百分数-50%91.6-50距离比例===0.8高于50%的百分数-低于50%的百分数91.6-40lgTCID此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数50=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID=10-3.850.Karber法病毒液稀释度lgTCID=L-d(s-0.5)50L:最高稀释度的对数8/8=18/8=17/8=0.8753/8=0.3751/8=0.1250/8=0D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID=-1-(-1)×(3.375-0.5)50=-3.875TCID=10-3.875/0.1ml50(三)病毒中和试验抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。2.病毒分离株的鉴定。3.不同病毒株的抗原关系研究。4.疫苗免疫原性的评价。5.免疫血清的质量评价。6.测定实验动物血清中是否存在抗体等。(一)终点法中和试验1.固定病毒——稀释血清法。1)将测好TCID的病毒稀释成200个TCID的病毒悬液。50502)在96孔微量培养板中将血清作连续倍比稀释(具体方法是在96孔板中先l24)同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照。5)感作完成后每孔加入100ul细胞悬液，放37℃5%CO2培养箱培养，逐日观Reed-Muench计算方法：血清稀释度数无CPE孔累计CPE孔数无CPE孔数保数护率(%)1:4(10-0.6)04091001:16(10-1.2)1315831:64(10-1.8)2232401:256(10-2.4)407001:1024401100 (10-3.0)高于50%的保护率—低于50%的保护率=0.7高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=-1.662.固定血清——稀释病毒法。23)另外还设两纵排正常细胞对照。4)置37℃5%CO培养箱培养，逐日观察并记录结果。25)分别计算每组病毒的TCID，然后计算血清的中和指数。试验组TCID50中和指数=50对照组TCID50(二)蚀斑(痘斑)减数试验病毒蚀斑：又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。原理：将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位。用途：①用于病毒纯化；②测定病毒悬液中感染病毒的含量。2、蚀斑减数试验将病毒——正常血清混合物以及病毒——待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。(2)应用已知免疫血清鉴定未知V(3)应用已知V鉴定未知血清(四)病毒的分离和鉴定料的注备1．脑、肝、肌肉等器官或组织2000rpm10min，取上清作接种物。2．鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物仔细用棉拭子擦拭咽喉部，并迅速将其泡入盛有2-5mlHank’s液的(200-500u/mlP.S)试管内，充分涮洗棉拭子，反复冻融3-5次，收集液体部4．粪便作接种物。5．无菌的体液或鸡胚液2．鸡胚3．组织培养细胞。定1．细胞病变(CPE)2．抗原的测定4．病毒间的干扰现象猪传染胃肠炎牛病毒性膜炎粘膜病V滴定LD、EID、TCID505050化学特性的测定1．病毒核酸型鉴定(药物抑制试验)FUDR、IVDR、BRUDR2．脂溶剂敏感性试验1)乙醚敏感试验醚，使终浓度为20%，两瓶均用橡皮塞塞紧后，置4℃冻箱内作用24h，其间不502)氯仿敏感性试验%，置4℃振荡混合10min。随后500rpm5min，然后吸取上层液体，滴定病毒TCID。对照组病毒加入终浓50度为4.8%的生理盐水，同样处理和滴定。3．胰蛋白酶敏感试验疱疹V易被胰酶灭活。取病毒液两瓶，每瓶1ml,在其中1瓶加入1ml1%的trypsin，使终浓度为0.5%，另一瓶加入1ml1640(培养基)，用橡皮塞塞紧瓶口，将小瓶倒转几次，使其充分混合，置37℃1h，随即加入灭活犊牛血清8ml，4．耐酸性试验pH3.02horpH5.01h取等量病毒液两瓶，用0.1mol/LHCL将1个小瓶中的病毒液的pH调至3.0(or5.0)，并在另一个小瓶内加入相同于用酸量的培养基作为对照，置37℃水溶或室温中感作2h(or1h)，再用5.6%NaHCO溶液将pH调回至7.2左右，对3照组再加紧入相同于NaHCO量的培养基，测定两者的TCID。3506．病毒粒子大小测定1)电子显微镜直接观察(透射电镜、磷钨酸负染)2)超速离心沉淀3)滤过试验滤膜就吸取1ml滤液用为样品，并将剩余的滤液通过一次滤膜。最后测定原病毒液以及各级滤液的病毒液种类滤前病毒液TCID。50TCID/0.1ml50目的：①新分离毒株的种类及型别的鉴定。②检测发病动物体液中的Ab，或进一步比较动物急性发病期和恢复期血(一)中和试验1．终点法中和试验固定病毒——稀释血清法中和试验固定血清——稀释病毒法中和试验2．蚀斑(痘斑)减数试验1)蚀斑技术病毒蚀斑，又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。原理：将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每毫升所含的蚀斑单位。用途：①用于病毒纯化；②测定病毒悬液中感染病毒的含量。2)蚀斑减数试验将病毒——正常血清混合物以及病毒——待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和斑减数试验效价。3．交叉保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。(2)应用已知免疫血清鉴定未知V； (3)应用已知V鉴定未知血清。 (五)凝集试验颗粒性抗原(如细菌、红细胞等)或表面载有抗原的颗粒状的物质(如聚苯乙烯胶乳、红细胞、炭素颗粒等)，与相应抗体在电解质存在下凝集成团的试间接凝集试验(被动凝集试验)：可溶性抗原吸附到载体颗粒表面，与相应抗体所发生的凝集反应，可以证明相应抗体的存在并测定效价。反相问接凝集试验(反向被动凝集试验)：将抗体吸附到颗粒表面与相应抗原所发生的凝集反应。应间接血凝试验胶乳凝集试验炭凝集试验皂土凝集试验脂质体凝集试验间接凝集试验间接凝集抑制试验：先将被检的抗体(或抗原)与已知的抗原(或抗体)作用后，再与抗体(或抗原)致敏的颗粒时行反应。反向凝集抑制试验间接血凝试验(IHA)(PHA)口蹄疫、猪瘟、弓形体、胸膜肺炎、衣原体红细胞作为载体的优点：1．来源广泛，容易取得。2．红细胞表面几乎可以吸附任何一类的Ag或Ab，如蛋白质、糖蛋白、核蛋白3．具有天然的均一性，比其它许多载体都更容易标准化和规格化。缺点：容易破裂、难于保存①敏感性高、特异性强、重复性和稳定性好，操作简便、反应迅速。②既可定性又可半定量，而且试剂价格低廉，不需要特殊、复杂的设备。注意：影响红细胞凝集的因素很多：红细胞的来源，致敏条件、操作技术、标本中的杂质、细菌污染和类属Ag常引起非特异性凝集反应。1．红细胞的选择和保存选择：许多种类动物的红细胞，包括人的0型红细胞都可用，但用得最多的是②采血时加等量氏液和适量抗生素，4℃保存2周，但这样红细胞致敏时容液自2．红细胞的醛化1)无菌采取绵羊静脉血，加至红细胞保存液内，4℃保存备用。17h。PH7.2PB配成8%悬液，——丙酮醛固定红细胞悬液。hr4℃冰箱内保存，可用2个月—双醛化红细胞悬液。3．红细胞的鞣化将其与红细胞悬液等量混合，37℃水浴咸4．致敏红细胞的制备：1)抗体致敏红细胞取20%鞣化或未鞣化的双醛化红细胞悬液1ml，离心沉淀，弃去上清液，将沉淀红细胞重新悬浮于醋酸缓冲液10ml中，加入等量的提纯IgG液(每毫升需含IgG100~300g)置37℃水浴中咸作2-4h，每15-20分钏用吸管轻轻吹吸混合2)抗原致敏红细胞悬液保存备用。长期保存：用含1%糖和4%兔血清的生理盐水，将致敏红细胞配成10%悬液，然后于真空中冷冻干燥。乳胶的预处理取空白乳胶用PBS(PH7.4)配成2%溶液，加入10%的胰蛋白酶液，使其终乳胶的致敏1．将浓缩的病毒抗原作倍比稀释(PBS)，加入等量的2%空白乳胶中(逐滴加(六)标记抗体技术(免疫标记技术)但此种结合反应肉眼不易察出。有一些物质在超微量时，即能用某种特殊理化因素将其检测出来。如将这些构标记在抗原或抗体分子上，就能利用调换体与原特异结合的特性，检测抗原或抗体，即免疫标记技术。荧光抗体技术(免疫荧光技术)同位素标记抗体技术(放射免疫测定技术)铁蛋白标记抗体技术免疫荧光技术基本方法和原理1．直接法将标记的特异荧光抗体，直接加在Ag标本上，经一定温度和时间的染色，用水洗去来参加反应的多余荧光抗体，室温干燥后封片，镜检。优点：方法简便，非特异荧光染色因素少。缺点：不够敏感，且一种标记抗体只能检测一种Ag。既可检查抗体，也可检查抗原。1)检查抗原用已知未标记的特异抗体(一抗)与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗体(二抗)与抗原标本反应，使之形成抗原一抗体——抗抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗抗体，干燥封片后镜检。Ab标本为已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤同上。缺点：但特异性较差。可能是间接法的中间层可结合更多的标记抗体所致。优点：敏感性高，且标记一种抗体球蛋白抗体，可用于多种抗原，抗体系统的检查。既可检测Ag，3．补体法应用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知Ag或未知Ab。先将未标记的Ab和补体加在Ag标本上，使其发生反应，随后再加标记抗体抗体，使之形成Ag—Ab—cb抗补体复合物。缺点：特异性较差。优点：敏感性高。标记一种抗体补体Ab，可用于各种Ag—Ab系统的检查(可用于各种动间接法：双层法、混合法、三层法。补体法：抗体一抗补体法、异属补体结合法。涂片压印片、冰冻切片、石蜡切片、组织培养物、可溶性Ag标本(醋酸评维素膜)。放射免疫测定技术随后根据Ag—Ab复合物中的同位素放射性强度进行定性或定量的测定。：敏感性和特异性都很强。缺点：射线污染。(一)液相放射免疫测定1．直接法(Ag、Ab)用放射性同位素标记病毒Ag或Ab。检测相应的Ab或Ag。主要同于颗粒性物质，如悬浮细胞内病毒抗原的初步检测，检测Ag时，通过超速离心将Ag—AbAg感作以后，再加入适当浓度(40-50%饱和度)的硫酸铵，叫Ag—Ab复合物盐2．间接法(主要用于病毒抗体的检测)被检血清+Ag+二抗离心沉淀3．竞争法(主要用于病毒抗原的检测)被检抗原+标定浓度的特异抗体，混合咸作一定时间再加入标定量的放射性同位素标记抗原—离心沉淀。(二)固相放射免疫测定(聚苯乙烯小管或微量滴定板上，或者用溴化氢、二醛等将Ab偶联或共价联结于琼脂糖珠或纤维素等表面)1．夹心法Ab+待检Ag+标记Ab2．夹心间接法，与上法相比，敏感性更强。3．竞争法 Ab包被+已知Ag+被检血清+同位素标记的Ab。(三)放射免疫自显影用同位素标记AborAg，然后进行琼脂扩散试验或免疫电泳对流免疫电脉，检测相应的AgorAb。扩散或电泳完毕后，将琼脂板置于盐水和ddHO中充分2影，即可在X光胶片上显示特异的沉淀线。免疫酶技术免疫酶染色法抗酶抗体法放大抗体法：同时使用酶标记抗体和抗酶抗体1．酶标记抗体法1)直接法的组织和细胞标本固定的消除其中的内源性酶以后，应用酶标记Ab直接处理，随后滴加底物显色，直接镜检。2)间接法再用酶标记的抗体处理，使其形成Ag-Ab-酶标记抗体复合物，最后滴加底物，2．抗酶抗体法不需进行酶的标记，比前都简便和灵敏1)免疫球蛋白桥法搭桥：用二抗(如抗兔IgG的抗体)将抗体和已结合在病毒抗原上的同种动物(兔)特异性Ab连接起来。2)可溶性酶——抗酶复合物法(PAP)3)杂交抗体法将来自同种动物的抗IgG抗体(或其Fab碎片)与抗酶抗体(或其Fab碎片)结合起来，使之成为一种具有抗IgG和抗酶双重活性的杂交抗体。再用这种杂交抗体进行免疫酶染色。Ag+Ab+杂交Ab+酶(一)免疫酶测定法均相免疫酶测定法：不需将游离的和结合的酶标记物分离，也不需要载体，直接从溶液中测定结果。1)酶联免疫吸附试验或测定法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。①间接法，用Ag包被板子+Ab(未知)+抗Ab+酶底物显色②双抗体夹心法，用于检测Ag。Ag+Ag(未知)+抗Ab+酶底物显色Ag)。对照组：只加酶标记Ag。④夹心间接法应用酶标记抗抗体测定Ag。Ab+Ag(待检)+不同种动物的同的Ab+酶标抗第二种抗体的动物球蛋白(二抗)2)特定Ag基质球法(Definedantigensubstratesphere,DASS)应用溴化氰活化的琼脂糖球作为固相载体，将Ag或Ab结合于其上，制成2．均相酶免疫试验(酶放大免疫试验)随后测定酶的活性。如果样品中主要用于激素、抗菌素和吗啡微生物等小分子聚苯乙烯微量反应板硝酸纤维素膜，斑点——ELISA(Dot—ELISA)疏水聚酯布，布——ELISA(C-ELISA)2．预备试验确定酶结合物、包被抗原或抗体的最适浓度，底物的最适反应时间。1)酶结合物的确定中进行包被,洗涤后将酶结合物以1:200,1:400,1:800……作系列稀释,依次加入各孔,每一稀释度加2孔。反应完毕后加底物显色，以能产生光吸收值(A)2)包被蛋白质浓度的确定将欲包被的蛋白质用PH9.6的碳酸盐缓冲液作1：10，1：20