免疫组化-双重染色

免疫组化双重染色方法和步骤：在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。目前，最常用的是最后一种方法。不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。试剂配制：1、 3%过氧化氢甲醇：30%H20210ml+纯甲醇90ml—充分混匀。2、 0.3%过氧化氢甲醇：30%H2O21ml+纯甲醇99ml—充分混匀。3、 免疫组化专用PBS(pH7.2—7.6):NaCI8.5g+磷酸氢二钠(无水)2.8g+磷酸二氢钠(无水)0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。然后测pH值使之在7.2—7.6。如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。4、 0.3%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)：TritonX-100是一种非离子型表面活性剂(或称清洁剂)，分子量为646.86(C34H62O11)。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。贮存液：30%TritonX-100:TritonX-10028.2ml+0.1mol/LPBS(pH7.3)或0.05mol/lTBS(pH7.4)72.8ml,37°C水浴中2~3h;工作液：0.3%TritonX-100:30%TritonX-1002ml用0.1mol/LPBS(pH7.3)或0.05mol/lTBS(pH7.4)定容至200ml。5、 柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)：BosterAR0024按说明配制。6、 封闭液：BSA+与第二抗体同源血清+免疫组化专用PBS，使BSA浓度为3%,与第二抗体同源血清浓度为10%。例：BSA0.6克，第二抗体同源血清2毫升，加免疫组化专用PBS定容至20毫升。7、SABC:按说明配制。

8DAB（Diaminobenzidine）显色液：按说明配制。9、1%盐酸-乙醇分化液：浓盐酸1ml+70%乙醇99ml。SABC法：W£审QtfH温册联堆2Qrlilri圳焙后*fiP»AWM的二甲華中-W3EIl£imin月見蜡tfl水化理瓷好fin页曲血銮筑盖ifliRTE尙即廉魄池利甩千证濃池.邑只防止千片旳闻灵话事振.天乓編可CAffrl晴几知神.帽圧”丟耳較净的话曲■通斗理曲AWHJ间」二IS1min1AJQ%己畔T5min旨min95^Z.Ks2min90%^892minao%z,o2min70%&gS2min藝屈水（＞N谢次d；Xtfl加妞胸的通适性0,3%的TritonX-10020min如胞腹抗is可PBS濫洗吕min（2甘f砍乂耳凉＞封呦内彗性过■化迥隔3%谊*i此殂甲畔10rnin验0.3%這和化仪甲畔3Dmin2»/^x3^PBS潦洗6min(2ft/J5tx3S»)微眩15阳扌伽修負（关脏牢毎）4Simin微泯S1档加热至沸IH；瞇N中低档iomin*品寺温廈在9弓弋“阴9;lfi后辰温30min1^自般净卸蔽壇水（＞2矽虑x3衣PBS漂洗30m4n(37XTEffi】浦纸囁干加1周囲的PRE曲居马上向坦坦画加対血加一fit燉出酬穂释JB的一抗过废｛週鹭甲”*迂冰躍）用含3%B5A利It昭dl；・与幣二折悴回沥》的PBS按说昭稀稗一抗.吹岀黠轴片,柚,嘅水城岳园啦干耳正向也壊闻翻口圧13的血奔.漓加秫需后的-抗”如虫僦对胆靈脸.就注对輛的盥上力QPB&„抗协浓腹需珈素”皿斗SEin(37P品艳)切片从4-G^aSSiAPBS扇睨片j貝退曬折廊烦擁结吉■想足°加二抗PBS需洗6min(2^/^K3S：)PBS预浅硼少耳贈辱性反应瞬后的二£130min（弍了弋温箱）之前阪＜紙尽园啪干正團组理周彌屋面的PBS」即用型二抗不删PBS瀟速Gmin(2S/?Sx3次)加SABC彌加SABC适變30min(37Xi£fi)之雨阳水瞬變呱干正面理H周圉和反面的PBS」SABC按说瞬配制Pbs漂洗15min（5好倔君籾】flfi□AB呂色剂5min(3~10mm)(££)之飾呱水瞬變呱干正面螂RI1圉和反面的PBS按说明配DA8显邑剤,观配现用.在30甘神内瞬rDAB致臥建轴下控制反应酗」贸邑时间达到鼻愉ft設下见阳性染色明显怛背晟不盂剧用PBS洗玄显色眩斗姥止展应PBS9min〔却分欲曲次丨苏木蠶复卿间需要理議,尤其劉雎染售迹细咆篠上时.醉敏flffi性染色._粗胞樓逼白连仇秒.胞浆或鋤塑自染20秒冲i頓显盡歸下碣.细胞艇色，细胞质无色為宜.翻胞核竝过漆.用L%1&駁乙畴港液曲色期渺」自乘水鮭・耐水Smiin5S—2min(-®205)5mmPBSEmin70%SB2min在二甲苯中.若焰妇切片上出现白色云霍r郦冃林不廉r应童新在新前100%乙欝中期＜.80%Z；B2min90%SB2min2min100%^E9I2mmioo%&@n2minSffi二押2mm二曲口2min封片中mats从二甲苯中取出切片.擁干阳間團的二甲苯.用中删胶當在輕育电.再用漕需盖璇片盖上.要制螂一闵r務后轻轻放下另一器，Uft产生气剋*封好片子后爵于通凤柜中晾干.注意事项:1、片子着色不均匀的原因如下：脱蜡不充分：可以60°C烤20min，立即放入新鲜的xylene1;水化不全：应经常配制新鲜的梯度乙醇；抗体没混匀：用移液器充分混匀一抗／二抗等试剂；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育后PBS冲洗不充分；制片厚薄不均匀等问题：染片盒不平，切片倾斜。2、切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗／二抗孵育时间、稀释抗体来控制；一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；DAB显色时间过长或浓度过高；PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。SP法1~6步骤与SABC法相同，但无需使用生物素阻断剂：切片加入A特异性抗体（如兔抗A抗体），4=C过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5分钟滴加生物素化二抗（如抗兔二抗），室温孵育切片10分钟，继而PBS冲洗3次，每次5分钟;滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟碱性磷酸酶显色液（BCIP/NBT）显色（紫蓝色）.PBS冲洗3次，每次5分钟；滴加0.05%盐酸，室温10分钟（可避免已显色的抗原褪色）;滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟;滴加B特异性抗体（如小鼠抗B抗体）,4~C过夜孵育。PBS冲洗3次，每次5分钟；滴加生物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟。PBS冲洗3次，每次5分钟：滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟过氧化物酶显色液（AEC）显色（鲜红色）.PBS冲洗3次，每次5分钟苏木精复染细胞核;18.水溶性封片剂封片。在使用SP法双重染色之前需要对待测抗原的性质、二抗的种属类型和显色系统进行详细设计。购买免疫组化双染试剂盒时;应选择与设计方案相同的配套试剂。在选择一抗时应避免定位在细胞的