发酵工艺综合实习指导书内容

目录综合实验一土壤中稀有放线菌的分离和纯化及抗生菌的体外抗菌鉴定综合实验二玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵综合实验三甜酒的酿造综合实验一土壤中稀有放线菌的分离和纯化及抗生菌的体外抗菌鉴定一土壤中稀有放线菌的分离和纯化1实验目的了解采集土样的规定和方法，掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术，学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。2实验原理筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。迄今为止，已发现的抗生素有80%皆来自于放线菌。放线菌重要存在于土壤中，并在土壤中占有相称大的比例。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、具有机质丰富的土壤中数量居多。通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。若以常规方法进行分离，得到的几乎所有是链霉菌。然而，当采用加热解决土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中涉及稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验重要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得少量稀有放线菌。3仪器和材料（1）培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。（2）灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水（含30粒玻璃珠），18×180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18×180mm试管中分装10ml1‰K2Cr2O7母液。（3）其它：采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔。4实验环节（1）采土：选择适宜采样地点。用采土铲去除表土，取5～10cm深处的土壤约150g左右，装入无菌牛皮纸袋中，并注明采样日期、地点、土壤类型、植被和采样人姓名等。（2）土样预解决：新鲜土样应适当风干，并喷施小剂量杀虫剂以防培养过程中虫卵发育的影响。（3）制备平板：每组取10套无菌培养皿，将冷却至50℃左右的各培养基，分别倒入平皿，每皿约15～20ml。每种培养基中需加入20ppm的K2Cr2O7溶液。在皿盖上注明培养基种类及组号。（4）制备土壤稀释液：每组称取10g土样，放入90ml无菌水中，得到土壤原液。手摇15～20min后，静置1min。再用无菌吸管取1ml上清液，置于9ml无菌水中，充足混匀，则得到10－2稀释液。依此类推，制备10－3、10－4稀释液（一般地，较肥的土壤使用10－3～10－5稀释液，而瘦土则使用10－2～10－4稀释液）。（5）铺平板：用1ml无菌吸管分别取0.1ml10－3～10－5稀释液，置于培养基平板中央。然后，再用无菌的玻璃刮铲均匀涂布，静置10min。每1稀释度3个反复，每1种培养基10套平板。并注明各稀释度。（6）培养及观测：将各平板置于28℃恒温箱中倒置培养14天。规定分别在第2天、7天和14天进行观测，并根据菌落大小、气生菌丝有无、气生菌丝和基质菌丝的颜色及可溶性色素有无等培养特性，选择单菌落放线菌进行纯培养，同时在平板背面的相应位置上作好标记。（7）纯培养：及时将选定的单菌落接入高氏1号琼脂斜面，每个菌株接1支斜面。必要时，中间可加1次划线分离培养，然后再转斜面。5结果与讨论将实验结果填入下表。思考题1、在分离土壤放线菌时为什么要选用多种培养基？2、在培养基中添加K2Cr2O7有何作用？二抗生菌的体外鉴别1实验目的了解抗生素产生菌体外筛选法的原理，学习并掌握抗生菌的鉴别方法。2实验原理由土壤中分出的放线菌需进一步鉴别是否为需要的抗生菌。一方面应根据筛选目的拟定实验模型，然后运用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其重要依据是扩散原理，即观测在抗生菌周边是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表白了该菌株抗菌活性的强弱。本实验选用了这两种方法。3仪器与材料（1）培养基：500ml三角瓶中分装300ml黄豆饼粉琼脂，18×180mm试管分装4ml黄豆饼粉浸汁，300ml三角瓶分装150ml细菌培养基，150ml三角瓶分装50ml马铃薯培养基。（2）实验菌：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）大肠杆菌（Escherichiacoli）金黄色葡萄球菌（Staphlococcusaureus）深红酵母（Ruodotorularubra）（3）待测菌株：琼脂培养物：将融化的黄豆饼粉琼脂倒入无菌培养皿，制成平板。用记号笔在平皿背面画一直线，将平皿一分为二，分别注明待测菌株的编号。并按照编号将待测菌株密集划线接入平板。同法接入华美链霉菌（Streptomycessplendens）和金霉素链霉菌（Streptomycesaureofaciens）作为对照菌，28℃下培养7天发酵液：将待测菌株和对照菌分别接入黄豆饼粉培养液，作好标记，28℃下振荡培养7天。（4）灭菌物品：培养皿，打孔器，镊子，圆滤纸片，15×150mm试管分装5ml无菌水，1ml吸管，无菌漏斗。（5）其它：接种用品，游标卡尺，记号笔，摇床。4实验方法4.1琼脂块法（1）分别取枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各1支，加入5ml无菌水制成菌悬液，备用。（2）取9套无菌培养皿，向每套培养皿中分别加入1ml实验菌悬液，然后加入约12ml冷却至45℃左右的细菌培养基，迅速在实验台上摇匀，制成指示菌平板。每1种指示菌3个反复，并注明指示菌及测定菌株的位置。（3）用无菌打孔器将待测菌株和对照菌的黄豆饼粉琼脂培养物切块，每种培养物9块。（4）用无菌接种针，将待测菌株和对照菌琼脂块分别移入各指示菌平板的相应位置上，菌面朝上，间隔均匀摆放。（5）静置20min后，放入恒温箱，37℃下培养18～24h。（6）用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观测抑菌圈的透明限度和边沿整齐限度。4.2滤纸片法(1)向深红酵母菌斜面中加入5ml无菌水，制成菌悬液。(2)向已冷却至45℃左右的马铃薯培养基中加入0.5ml深红酵母菌悬液，摇匀后，倒3个指示菌平板，并在平皿背面标明测定菌株的位置，备用。(3)过滤各测定菌株的发酵液。(4)用无菌镊子取无菌的圆滤纸片，蘸取各测定菌株的发酵滤液，放入指示菌平板的相应位置上，每1测定菌株3个反复。(5)静置20min后，28℃下培养2天。(6)用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观测抑菌圈的透明限度和边沿整齐限度。5结果将实验所得结果填入下表，抑菌圈直径以mm来表达。思考题1、为什么在移入琼脂块和滤纸片后不立即保温培养？2、抑菌圈小是否就意味着菌株的抑菌活性差？为什么？实验进度安排第一天：设备准备，土壤采样，培养基准备第二天：培养基准备，分离稀有放线菌体第三天：土壤稀释法和微生物的纯培养第四天：琼脂块法筛选，滤纸片法筛选培养第五天：实验结果观测总结报告撰写综合实验二玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵1实验目的及规定规定学生掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法，淀粉水解糖酒精发酵方法。掌握粗淀粉含量和还原糖、酒精含量的化学测定方法。2实验原理发酵过程中，有些微生物不能直接运用淀粉，因此，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水解成葡萄糖，才干供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所制得的糖液称为淀粉水解糖。发酵生产中，淀粉水解糖液的质量，与生产菌的生长速度及产物的积累直接相关。可以用来制备淀粉水解糖的原料重要有薯类(木薯、甘薯)淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等，根据原料淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同，水解淀粉为葡萄糖的方法可分为酸解法、酸酶结合法和酶解法。实验室中常采用酶解法制备淀粉水解糖。酶解法是指运用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第l步是运用α-淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增长，这个过程称为液化；第2步是运用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。运用酒精酵母将可酵糖转化为酒精的过程称为发酵。2.1酶法液化原理淀粉的酶法液化是以α-淀粉酶为催化剂，该酶作用于淀粉的α-1,4糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后，其碘色反映发生如下变化：蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)。酶法液化以生产工艺不同分为间歇法，半连续和连续式；液化设备有：管式、罐式、喷射式。加酶方法有：一次加酶、二次加酶、三次加酶。根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法、或中温酶和高温酶混合法。本实验采用：中温酶法，间歇式，罐式，二次加酶法。2.2酶法糖化原理淀粉的糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非还原末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉的α-1，4糖苷键或α-1，6糖苷键。由于是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率：由于在糖化过程中，水参与反映，故糖化的理论收率为111.1％。（C6H10O5)n+H2OnC6H12O616218180淀粉糖化实际收率的计算：淀粉转化率：淀粉-葡萄糖转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。淀粉转化率的计算：DE值：用DE值表达淀粉水解的限度或糖化限度。糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质的比例称为DE值。DE值计算：还原糖用裴林氏法或碘量法测定，浓度表达：葡萄糖g/100ml糖液；干物质用阿贝折光仪测定，浓度表达：干物质g/100g糖液。影响DE值的因素：糖化时间：最初糖化时，糖化速度快，DE值显著上升；但24h后，当DE值达成90％以上时，糖化速度显著放慢。液化DE值与糖化DE值的关系：液化限度应控制适当，太低或太高均不利。因素是液化限度低，则粘度大，难操作；同时，由于液化限度低，底物分子少，水解机会少，影响糖化速度；液化限度低，易发生老化；但液化超过一定限度，则不利于糖化酶与糊精生成络合结构，影响催化效率，导致糖化液的最终DE值低。故应在碘试本色的前提下，液化DE值越低，则糖化液的最高DE值越高。一般液化DE值应控制在12-18％。酶制剂用量与糖液DE值的关系：糖化时间与糖化酶用量关系表糖化时间（h）68101624324872糖化酶用量（U/g淀粉）480400320240180150120100为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间。但酶用量太高，反而使复合反映严重，最终导致葡萄糖值减少。在实际生产中，应充足运用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少糖化酶用量。2.3酒精发酵原理以淀粉为原料，采用酸水解、酸酶结合水解或酶水解方法，可以将淀粉转化为葡萄糖等可酵糖。运用酒精酵母胞内的酒化酶系，葡萄糖被转化为酒精即酒精发酵。以生产工艺不同，酒精发酵可分为间歇式、半连续式、连续式过程，各种过程又可以细分为多种形式。本实验采用酶法糖化、一次添加间歇式方法进行酒精发酵。3实验仪器、设备和材料（1）1000ml烧杯（2）真空过滤装置（3）烘箱（4）量杯（5）量筒（6）分光光度计（7）水浴锅（8）滴定管（9）电炉（10）白瓷板（11）三角瓶（12）阿贝折光仪（13）玉米粉（14）α-淀粉酶（15）糖化酶（16）pH试纸（17）酒精活性干酵母（18）酒精蒸馏装置及酒精计4实验环节4.1淀粉水解糖的制备4.1.1淀粉的液化配制30％的淀粉乳，调节pH值至6.5，加入氯化钙(对固形物0.2％)，在3个1000ml烧杯中分别加入淀粉乳700ml并分别加入液化酶12U/g淀粉、16U/g淀粉、20U/g淀粉，在剧烈搅拌下，先加热至72℃，保温15min，再加热至80℃~90℃（视酶的特性而定），并维持30min，以达成所需的液化限度(DE值：15-18％)，碘反映呈棕红色。液化结束后，观测液位，再升温至100℃4.1.2淀粉的糖化（糖化酶用量对糖化的影响）液化结束后，迅速将料液用盐酸将pH调至4.2-4.5，同时迅速降温至60℃。将液化醪混匀后均分为3份，分别加入糖化酶320U/g淀粉、400U/g淀粉、480U/g淀粉，60℃保温，每隔2小时，取样做酒精实验。当用无水酒精检查无糊精存在时，即为糖化终点，记录糖化时间，同时将料液pH调至4.8-5.0，并将料液加热至80℃，保温20min．然后将料液温度降至60-70℃，开始过滤。4.1.3过滤将烧杯内的料液冷却至60-70℃；趁热采用真空过滤（也可用滤布压滤），热水洗涤(60-70℃)滤饼；过滤结束后，洗净过滤的有关设备。量取糖液体积；取样分析还原糖浓度。4.2酒精发酵4.2.1酒精酵母的活化：称取2g蔗糖，溶于100ml经煮沸并冷却的水中，加入1g活性干酵母于培养箱中30℃4.2.2清糖液发酵：将4.1方法制备的淀粉水解糖调整浓度为15%左右，于500ml三角瓶中加入该糖液200ml，用无菌吸管取5ml活化酵母，摇匀，密封三角瓶，置入培养箱中于32℃4.2.3混合醪发酵：（1）液化：称取2份各50g玉米粉，置于500ml三角瓶中，混匀，记下液面刻度，加入α-淀粉酶（酶用量为4U/g淀粉原料）进行液化，得到糊化醪。液化温度为85℃，液化时间为30min，然后冷却至58~60（2）糖化：在糊化醪中分别加入糖化酶200U/g淀粉原料和400U/g淀粉原料，在58~60℃（3）发酵：将糖化醪冷却至30℃，用无菌吸管接入活化酵母液5ml，摇匀，密封容器，置入培养箱中于325实验分析项目和方法5.1淀粉原料含水量的测定5.1.1原理样品中的水分受热后产生的蒸汽压，高于空气在电热干燥箱中的分压，水分便从样品中挥发出来。样品干燥的速度取决于这个压差的大小，在此条件下失去的重要是试样中的游离水。试样的水分一般是指在100℃5.1.2仪器与设备（1）分析天平（2）称量瓶（3）干燥器（4）电热恒温干燥箱5.1.3测定环节准确称取约2克试样，置入经100-l05℃干燥恒重后的称量瓶中，在100-105计算式中W0：称量瓶重（g）W1：干燥前试样与称量瓶重（g）W2：干燥后试样与称量瓶重（g）5.1.4说明（1）原料的水分测定一般需采用100-105℃烘箱中直接干燥，其结果较为准确。对生产过程中的水分快速测定，可采用更高温度下干燥(如120-140（2）测定水分时，称量恒重指试样连续两次干燥后，称量之差不超过2mg。5.2淀粉原料中粗淀粉含量的测定5.2.1原理淀粉经酸或水解生成葡萄糖：所生成的葡萄糖用斐林试剂测定。斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙液分别贮存，测定期甲、乙液等体积混合。混合时，硫酸铜与氢氧化钠反映，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH+CuSO4=Cu(OH)2↓+Na2SO4所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反映，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解：酒石酸钾纳铜络合物中二价铜是一个氧化剂，能使还原糖中羰基氧化，而二价铜被还原生成一价的氧化亚铜沉淀：反映终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜所有被还原后，过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液蓝色消失以示终点：5.2.2试剂5.2.2.1斐林试剂甲液：称取69.3克硫酸铜(CuSO4·15H2O)，用水溶解并稀释至1000毫升，如有不溶物可用滤纸过滤。乙液：称取346克酒石酸钾钠，100克氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000毫升。5.2.2.22％盐酸溶液量取4.5毫升浓盐酸，用95.5毫升水稀释。5.2.2.320％盐酸溶液量取20毫升浓盐酸，缓慢倒入80毫开水中。5.2.2.420％氢氧化钠溶液称取200克氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000毫升。5.2.2.51％次甲基蓝溶液称取1克次甲基蓝，加100毫升水，加热溶解，贮存于棕色瓶中。5.2.2.60.2％标准葡萄糖溶液准确称取2克无水葡萄糖(预先于100~l05℃5.2.3仪器与设备（1）三角瓶（2）长玻璃管(约1米)（3）容量瓶（4）分析天平（5）干燥器（6）电热恒温干燥箱（7）滴定管（8）称量瓶（9）移液管（10）pH试纸（11）电炉（12）水浴锅5.2.4测定环节5.2.4.1试样水解粗淀粉测定中试样水解：准确称取试样1.5~2克，置入250毫升三角瓶中。加l00毫升2%盐酸溶液，轻轻摇动三角瓶，使试样充足湿润。瓶口按上回流冷凝器或长玻璃管(约1米)，于沸水浴中回流水解3小时(图2-1)。取出，迅速冷却，用20％氢氧化钠溶液中和至中性或微酸性(用pH试纸实验)。滤纸过滤滤液用500毫升容量瓶接受，用水充足洗搽残渣，然后用水定容至刻度，摇匀，为供试糖液。5.2.4.2斐林试剂的校正吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加20毫升水，并从滴定管中加入约24毫升0.2％标准葡萄糖溶液(其量应控制在后滴定期消耗0.2％标准葡萄糖溶液在1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟。加2滴1％次甲基蓝溶液继续用0.2％标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完毕。总耗糖量为v毫升。图2-1水解装置校正值的计算：先求得10毫升斐林试剂相称的葡萄糖克数(F)，F=CV式中C：标准葡萄糖溶液浓度(g/ml)再从斐林试剂糖量表(见附表2-1)查得V毫升时相称的葡萄糖克数(F0)，斐林试剂校正值f为：5.2.4.3定糖吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加20毫升水，并从滴定管中预先加入适量的水解糖液(其量应控制在后滴定期消耗水解糖液在1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2分钟。加2滴1％次甲基蓝溶液，继续用水解糖液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完毕。5.2.5计算从附表2-1查得10毫升斐林试剂消耗水解糖液体积相称于100毫升水解糖液中所含葡萄糖量（G），则1毫升水解糖液中含葡萄糖量为G/100，再乘以斐林试剂校正值，即为1毫升水解糖液中实际含葡萄糖量：式中500：试样稀释体积（ml）W：试样重量（g）0.9：葡萄糖与淀粉的换算系数附表2-1斐林试剂糖量表消耗糖液体积(毫升)相称葡萄糖量(毫克)100毫升糖液中所含葡萄糖的量(毫克)消耗糖液体积(毫升)相称葡萄糖量(毫克)100毫升糖液中所含葡萄糖的量(毫克)15161718192021222324252627282930313249.149.249.349.349.449.549.549.649.749.849.849.949.950.050.050.150.250.2327307289274260247.4235.8225.5216.1207.4199.3191.8184.9178.5172.5167.0161.8156.933343536373839404142434445464748495050.350.350.450.450.550.550.650.650.750.750.750.850.950.951.051.051.051.1152.4148.0143.9140.0136.4132.9129.6126.5123.6120.8118.1115.5113.0110.6108.4106.2104.1102.25.3测定液化反映终点(碘反映)；5.4糖化终点测定(无水乙醇检查)；5.5还原糖的测定5.5.1原理原糖的测定采用快速法。其反映与粗淀粉测定相似，不同点为斐林试剂甲液中硫酸铜量较小，合用于含糖量较少的试样。此外，斐林试剂中加入亚铁氰化钾(黄血盐)，使红色氧化亚铜沉淀生成可溶性的复盐，反映终点更为明显。Cu2O+K4Fe(CN)6+H2O=K2Cu2Fe(CN)6+2KOH(淡黄色)5.5.2试剂5.5.2.1斐林试剂甲液：称取35g硫酸铜，0.05g次甲基蓝，用水溶解并定容至1000ml。乙液：称取117g酒石酸钾钠，126.4g氢氧化钠，9.4g亚铁氰化钾，用水溶解并定容至1000ml。5.5.2.20.1%标准葡萄糖溶液精密称取1.0000g经95~105℃烘干的无水葡萄糖，用少量水溶解，加入5ml5.5.3仪器与设备（1）三角瓶（2）容量瓶（3）分析天平（4）干燥器（5）电热恒温干燥箱（6）滴定管（7）称量瓶（8）移液管（9）电炉5.5.4测定环节5.5.4.1斐林试剂的标定吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加10毫升水，并从滴定管中预先加入约20毫升0.1%标准葡萄糖溶液(其量控制在后滴定期消耗0.1%标准葡萄搪溶液1毫升以内)，摇匀，于电炉上加热至沸，立即以4~5秒钟1滴的速度继续用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1分钟内完毕，总耗糖量为V0毫升。5.5.4.2定糖预备实验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加入V1毫升试样稀释液(含葡萄糖量约为5~15毫克)及适量的0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，以下同标定期操作，总耗糖量为V2毫升。正式实验：吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加V1毫升试样稀释液和(V2-1)毫升0.1%标准葡萄糖溶液，补加[(V0+10)-(V1+V2)]毫升水，摇匀，以下同标定期操作，总耗糖量为V毫升。反复测定两次，取总消耗标准葡萄糖液体积的平均值Vml。5.5.5计算式中V0：斐林试剂标定值(毫升)V：斐林试剂测定值(毫升)C：标准葡萄糖溶液浓度(克/毫升)n：试样稀释倍数v1：所取试样稀释液体积(毫升)5.5.6说明(1)滴定速度、三角瓶壁厚度和热源的稳定限度等，对测定精密度影响很大。平行测定的滴定毫升数相差不应超过0.1ml，故在标定、预备、正式测定过程中，实验条件应力求一致。(2)滴定过程应当始终保持在微沸状态下进行。沸腾后继续滴定至终点的毫升数应控制在0.5~lml内，否则应重新测定。(3)样品液中还原糖浓度不宜过高或过低，根据预备实验结果，应将样品液稀释至还原糖的含量在1%左右为宜。(4)滴定至终点蓝色褪去之后，就不应再滴定，因四甲基蓝指示剂被还原褪色后，当接触空气时，又会被氧化重现篮色。(5)斐林溶液与还原糖之间的反映因受溶液碱性、加热湿度和时间以及副反映等影响，而没有严格的定量关系，不能由当量定律来求出试样中还原糖的含量，只熊根据在相同实验条件下消耗相应的标准还原糖量或由严格相同的实验条件下得出的还原糖检索表上查得相应的还原糖量来进行计算。所以用廉-爱农法定糖时，必须先用相应的标准还原糖标定斐林溶液。5.6酒精含量测定采用国标方法——蒸馏法。用量筒量取成熟发酵醪100ml置于500ml蒸馏烧瓶中，加入蒸馏水100ml，装好蒸馏装置，加热，保持发酵成熟醪始终处在微沸状态，用100ml量筒收集馏出液100ml，停止蒸馏。用酒精计测定馏出液的酒度，同时测定馏出液的温度，以便对酒精度进行温度校正。5.7α-淀粉酶活力测定5.7.1原理液化型淀粉酶(即α-1，4-糊精酶，俗称α-淀粉酶)能将淀粉分子键的α-1，4-葡萄糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精，以及少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色特异反映逐渐消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。5.7.2试剂5.7.2.1原碘液称取碘(I2)11g，碘化钾(KI)22g，先用少量蒸馏水使碘完全溶解后定容至500m1，贮于棕色瓶内。5.7.2.2稀碘液取原碘液2m1，加入KI20g，用蒸馏水溶解定容至500ml，贮于棕色瓶内。5.7.2.32%可溶性淀粉精确称取2.000g可溶性淀粉(以绝干计)，然后用少量蒸馏水调匀，渐渐倾于煮沸的蒸馏水中，加热煮沸至透明为止，冷却定容至100ml。此溶液需当天配制。5.7.2.40.02mol/LpH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·H2O)45.2g和柠檬酸(C6H8O7·H2O)8.07g，用蒸馏水溶解定容至1000ml，配好后应以酸度计或精密试纸校正pH。5.7.2.5标准终点色溶液A液精确称取氯化钴(CoCl·6H2O)40.2439g和重铬酸钾(K2Cr2O7) 0.4878g，以蒸馏水溶解定容至500ml。B液精确称取铬黑T(C20H12N2NaO7S)10mg，以蒸馏水溶解定容至100mI。使用时取A液40m1与B液50ml混合。此混合液宜冰箱保存，使用15天后需要重新配制。5.7.3操作环节5.7.3.1待测酶液的制备取发酵液的滤液用pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释，供测定用。5.7.3.2测定取2ml标准终点色溶液滴于白磁板空穴内，作为比较颜色的标准。取20ml2%可溶性淀粉和5m1pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，放于20×200mm大试管中，在60℃恒温水浴中预热4-5min．然后加入预先稀释好的酶液0.5m1，立即记录时间，充足摇匀。定期用滴管取出反映液约0.5m5.7.4计算1m1酶液于60℃，pH6.0的条件下，用1h液化可溶性淀粉的克数来表达（g可溶性淀粉/m1·式中60：60min20：可溶性淀粉的毫升数n：稀释倍数t：测定记录时间(min)2%：淀粉浓度0.5：测定期的用酶量5.7.5注意事项（1）酶反映所有时间控制在2~2.5min之间（酶活力10~15单位）。（2）为统一起见，可溶性淀粉使用同一厂家生产的化学纯试剂。（3）测定期照明采用40W日光灯，灯与白磁板的间距以60cm为宜。5.8糖化酶活力测定5.8.1原理糖化型淀粉酶（即淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶）有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖，反映生成的葡萄糖用次碘酸钾法定量测定，以表达糖化性淀粉酶的活力。5.8.2试剂5.8.2.10.1mol/LpH4.6醋酸钠缓冲液称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)6.7g和冰醋酸(CH3COOH)2.6m1，用蒸馏水溶解，定容至1000m1。上述缓冲液应以酸度计或精密试纸校正pH。5.8.2.20.1mol/L硫代硫酸钠溶液(1)配制：称取硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)24.82g和硫酸钠0.2g溶于煮沸后冷却的蒸馏水中，定容至1000ml，即得0.1mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。0.05mol/L溶液则用蒸馏水稀释制得。(2)标定：取在120℃下干燥至恒重的标准重铬酸钾0.25g．精密称量。置碘量瓶中，加水50m1使溶解，加碘化钾2g。轻轻振摇使溶解，加1mol/L硫酸溶液40m5.8.2.30.1mol/L碘液称取碘化钾(K1)36g，溶解在100m1蒸馏水中，再加入碘(I2)12.98g溶解，定容至1000ml贮存于棕色瓶中。用标准的0.05mol/L硫代硫酸钠溶液标定碘液。吸取10ml待标定的碘液放入250m1碘量瓶中，以0.05m/L硫代硫酸钠滴定至淡黄色时，加入1%淀粉指示剂l-2滴，继续滴定至无色为终点。式中N1：硫代硫酸钠的浓度(mol/L)V1：消耗硫代硫酸钠的毫升数V：碘液毫升数5.8.2.40.1mo1/L氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠(NaOH)加蒸馏水溶解，定容至1000ml。5.8.2.51mol/L硫酸溶液量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。5.8.2.620%氢氧化钠溶液称取20g氢氧化钠，溶解定容至100ml。5.8.2.72%可溶性淀粉称取可溶性淀粉2g，然后用少量蒸馏水调匀，渐渐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。5.8.3操作方法5.8.3.1待测酶液的制备取发酵液的滤液用pH4.6醋酸钠缓冲液适当稀释，供测定用。5.8.3.2测定于甲、乙两支比色管中(50ml)，分别加入20%可溶性淀粉溶液25m1及0.1mol/LpH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液5ml，摇匀，40℃的恒温水浴中预热(5-10min)。在甲管中加入酶液2ml(酶活总量约100-170单位)，立即记时间，摇匀。在此温度下准确反映1h后，立即各加20%NaOH溶液0.2m1，摇匀，将两管取出迅速用水冷却，并于乙管中补加酶液2m取上述反映液5m1放入碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘液10ml，再加入0.1mol/L氢氧化钠15ml(边摇摆)。暗处放置15min，加入1mol/L硫酸2m1，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无色为终点。5.8.4计算糖化酶活力单位的定义：在40℃式中A：空白所消耗硫代硫酸钠毫升数5：样品所消耗硫代硫酸钠毫外数N：硫代硫酸钠摩尔浓度90.05：1mllmol/L硫代硫酸钠所相称的葡萄糖毫克数1/2：折算成1m1酶液的量32.2：反映液总体积毫升数5：吸取反向液毫升数n：稀释倍数5.8.5注意事项（1）酶液制备时，酶液浓度最佳控制在消耗0.05mol/L硫代硫酸钠（空白和样品）的差数为3~6ml左右(以每毫升约50~90单位为宜)。（2）为统—起见可溶性淀粉使用浙江菱湖淀粉厂生产的化学纯试剂配制，如暂不能购制，而需使用其他厂生产的可溶性淀粉时，必须做对照实验。6数据解决在具体记录实验数据的基础上完毕实验报告。计算淀粉转化率和淀粉出酒率。7实验结果和讨论糖化酶用量及糖化时间对糖化效果的影响；液化和糖化时温度及pH对实验效果的影响。糖化酶用量对出酒率的影响？实验进度安排第一天：实验准备：仪器、药品、玻璃器皿，实验原料。第二天：淀粉的液化，糖化，过滤第三天：酒精发酵操作第四天：测定用试剂的配置，各种指标的测定第五天：各种指标的测定，实验总结，报告撰写综合实验三甜酒的酿造1实验目的及规定规定学生掌握甜酒的酿造原理及工艺流程；掌握甜酒酿造过程中酒曲中糖化酶的活力测定方法；成品总糖、还原糖含量、酒精度及总酸度的测定原理及方法。2甜酒概述甜酒的酿造，重要采用甜酒曲。甜酒曲是糖化菌及酵母制剂，其所含的微生物重要有根霉、毛霉及少量酵母。在发酵过程中根霉产生糖化酶，一方面将糯米中的淀粉分解成葡萄糖，蛋白质分解成氨基酸，接着少量的酵母又将葡糖糖经糖酵解途径转化成酒精。这样就制成了香甜可口、营养丰富的甜酒酿。

甜酒酿是米酒曲的最初产品，它是各类酒类制作的雏形，除了食用外，尚有两种用途，一是作为料酒使用，如川式火锅，豆瓣酱中添加；二是制作馒头，如河南周口的米酒馒头、浙江金华的米酒馒头。此外，甜酒曲还可以在调料发酵中使用，因此，甜酒曲的用户有甜酒酿工厂、家庭、餐饮单位、调料生产单位。

甜酒酿作为料酒使用，重要是运用其良好的口感的独特的风味，在调味的过程中，它既具有一定的酒香，又有酸、甜的口味，能起到处腥膻异味、提鲜增香等作用，使菜肴风味独特，口味柔和，已经成为烹饪菜肴时不可缺少的调味品。

甜酒酿在制作馒头中使用，最重要的代表在河南周口和浙江金华，具有很强的地方传统色彩，一般都称之为米酒馒头。米酒馒头的制作方法有很多种，有的是直接运用甜酒曲长时间发酵面团，制作馒头；有的是运用甜酒酿中的酒水作为面团用水，在添加适当的酵母，制作馒头，这种发方法在金华最典型；尚有的是将甜酒酿和面粉共同长时间发酵，制作馒头。虽然方法不尽相同，但这些馒头都具有甜酒酿特有的醇香风味，并且口感细腻，是非常具有民族传统特色的食品。

甜酒曲用于调料发酵，重要是运用甜酒曲中根霉极强的糖化性能。例如酱品的制作，它是以淀粉质和蛋白质材料作为重要原料，在制作过程中起重要作用的是根霉菌株产生的糖化霉系和蛋白酶系，通过糖化作用，将淀粉质分解成糖；通过蛋白酶系对蛋白质的水解发酵作用，产生各种氨基酸，这样就形成了酱类的甜味和鲜味。然后再通过酵母的酒精发酵作用和细菌的乳酸发酵作用，就得到了风味各异的酱品。

由此看来，甜酒曲及甜酒酿的用途的确十分广泛，当然，甜酒曲及甜酒酿的用途也未必只有这些，还需要我们在生活和研究中不断的发现和创新。实验分为三部分进行：α-淀粉酶活性的测定、甜酒的酿造、成品指标检测（酒精含量、总糖、总酸度的测定）3α-淀粉酶活性的测定3.1原理液化型淀粉酶(即α-1，4-糊精酶，俗称α-淀粉酶)能将淀粉分子键的α-1，4-葡萄糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精，以及少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色特异反映逐渐消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。3.2试剂3.2.1称取分析纯结晶碘11g,分析纯碘化钾22g,先用少量蒸馏水使碘完全溶解后,再加蒸馏水定容至500mL3.2.2稀碘液:取原碘液2mL,加碘化钾20g,加蒸馏水溶解定容至500mL,贮于棕色瓶内。3.2.32％可溶性淀粉(HG3-3095):称取2.00g可溶性淀粉(以绝干计)用少量蒸馏水调匀,渐渐倾入煮沸的蒸馏水中,加热煮沸至透明为止,冷却定容至100mL。此溶液当天配制。3.2.40.02M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(pH6.0):称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),45.23g和柠檬酸(C6H8O7·H2O)8.07g,用蒸馏水溶解定容至1000mL,配好后应以酸度计校正pH值为6.0。3.2.5A液:称取分析纯氯化钴(COCl2·6H2O)40.2439g和分析纯重铬酸钾0.4878g以蒸馏水溶解定容至500mL。B液:称取络黑T(C20H12N3NaO7S)40mg以蒸馏水溶解定容至500mL。使用时取A液40mL与B液5.0mL混合。此混合液宜冰箱保存,使用15天后需要重新配制。3.3测定环节3.3.1待测酶液的制备称取酶粉1.0000～2.0000g或1.00mL酶液,先用少量的400.02M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(pH6.0)溶解,并用玻璃棒捣碎,将上层清液小心倾入适当的容量瓶中,沉渣部分再加入少量上述缓冲溶液,如此反复捣研3～4次,最后所有移入容量瓶中,用缓冲溶液定容至刻度,摇匀,通过4层纱布过滤再用滤纸滤清,滤液供测定用。3.3.2取2mL标准终点色溶液于白瓷板空穴内,作为比较颜色的标准。取2％可溶性淀粉20mL和pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液5mL放于25mm×200mm试管中,在60℃恒温水浴中预热4～5min。然后加入预先稀释好的酶液0.5mL,立即记录时间,充足摇匀,定期用吸管取出反映液0.5mL,滴于预先充满比色稀碘液(约1.5mL)的白瓷板空穴内,当穴内颜色反映由紫色逐渐变为红棕色,与标准终点色相同时,即为反映终点,并记录时间(分钟)。注:①酶反映所有时间控制在2～2.5min之内。②测定期照明采用40瓦日光灯,灯与瓷板的间距应为60min左右为宜。③白瓷板可用10mL比色管代替。3.3.3计算1g酶粉或1mL酶液于60℃、pH6.0条件下,以1h液化可溶性淀粉的克数来表达(克可溶性淀粉/克小时或克可溶性淀粉/毫升·小时)。式中:X——酶活力单位,u/g;n——稀释倍数;T——测定记录时间,min;60——分钟数;20——可溶性淀粉的毫升数;2％——淀粉浓度;0.5——测定期稀酶液用量,mL。4.甜酒的发酵4.1原理：甜酒的酿造，重要采用甜酒曲。甜酒曲是糖化菌及酵母制剂，其所含的微生物重要有根霉、毛霉及少量酵母。在发酵过程中根霉产生糖化酶，一方面将糯米中的淀粉分解成葡萄糖，蛋白质分解成氨基酸，接着少量的酵母又将葡糖糖经糖酵解途径转化成酒精。这样就制成了香甜可口、营养丰富的甜酒酿。4.2原料配方：糯米1kg，甜酒曲10g4.3器材搪瓷盆、锅、三角瓶、纱布4.4工艺流程：糯米→淘洗→浸泡→冲淋→蒸熟→降温→糖化（加甜酒曲）→发酵→冷却→成品4.5制作环节：4.5.1清洗、浸泡：将糯米淘尽，浸泡12小时，用清水冲淋4.5.2蒸饭：将米沥干水后装在蒸笼内，蒸至米粒变色呈晶状，即已熟透。（大约15分钟）4.5.3降温：用冷开水浇淋米饭，使温度降到温热合适时，沥去水分。4.5.4糖化、发酵：将降温后的米饭倒入已灭菌的容器中，将酒曲研成粉末加入米饭中，搅拌均匀。再盛入已灭菌的三角瓶中，按平。中心戳一圆洞，三角瓶加塞，在30℃以上条件下糖化和发酵24h-48h。待中心洞眼中有酒酿汁渗出时，即可结结束发酵。4.5.5冷却：发酵完毕后再移植到较低温度处放置，以防止发酵过渡和变质。5.酒精含量测定（分光光度计法）5.1测定原理挥发的酒精与重铬酸钾、浓硫酸反映生成绿色的硫酸铬，色泽的深浅在一定范围与酒精浓度成正比，因此可通过测定醪液的OD值即可从标准曲线上查出醪液酒精含量。5.2试剂5.2.11.0%标准酒精溶液：准确吸取1.0m1(AR级)无水酒精，于100ml容量瓶中,定容到刻度。5.2.22％重铬酸钾溶液：称取2g重铬酸钾(K2Cr2O7)，溶于水，并稀释至l00ml5.2.3浓硫酸：CP级，98%，相对密度1.84。5.3仪器HH-S11.2型电热恒温水浴锅、721型分光光度计5.4测定环节5.4.1样品预解决称取10g酒醅，于500ml蒸馏烧瓶中，加蒸馏水15.4.2标准曲线的绘制取1.0%乙醇的乙醇用蒸馏水按表1稀释。取各稀释液5.0ml于试管中，在各试管中加入2.5ml2.0%的K2Cr2O7和10.0ml98%H2SO4，摇匀，沸水浴中加热10min，冷却，600nm测定吸光度。作标准曲线，如图1。得线形回归方程：Y=0.7173X-0.0024Y：馏出液中乙醇的百分含量（V/V）X：吸光度A0.0024：补尝参数表11.0%乙醇序列稀释度稀释编号0＃1#2#3#4#5#6#7#1.0%乙醇ml0.00.51.01.52.02.53.03.5蒸馏水ml10.09.59.08.58.07.57.06.5

图1乙醇浓度-OD值关系曲线5.4.3酒醅中乙醇含量的计算：C1：酒醅中乙醇的百分含量，V/M。Y：馏出液中乙醇的体积百分浓度％m：蒸馏酒醅的质量g100：馏出液的体积ml6．还原糖、总糖的测定6.1原理将一定量的碱性酒石酸铜甲\乙液等量混合，立即生整天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀不久与酒石酸钾钠反映，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定,样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反映，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜所有被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。根据样液消耗量可计算出还原糖含量。各步反映式(以葡萄糖为例)如下：(1)(3)6.2试剂6.2.1碱性酒石酸铜甲液：称取15g的硫酸铜（CuSO5H)及0.05g次甲基蓝,溶解于水中并稀释到1000ml。6.2.2碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g的氢氧化钠溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000ml，贮存于橡皮塞玻璃瓶中。6.2.3乙酸锌溶液：称取21.9乙酸锌（Zn(CH3COO)2·2H2O），加3ml冰醋酸，加水溶解并稀释至100ml。6.2.410.6%亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]，溶于水中，稀释至100ml。6.2.50.1%葡萄糖标准溶液：准确称取1.0000g（精确至0.0001g）经98～100℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加水溶解后移至1000ml的容量瓶中，加5ml盐酸（防止微生物生长），并用水稀释至1000ml。6.2.66mol/L盐酸溶液6.2.70.1%甲基红乙醇溶液：称取0.1g甲基红，用60%乙醇溶解并定容到100ml。6.2.820%氢氧化钠溶液。6.3器材：分析天平、电炉、石棉网、恒温水浴锅、研钵、试剂瓶、滴定架、滴定管、移液管、容量瓶、三角锥形瓶、脱脂棉、纱布或滤纸6.4测定环节6.4.1准确称取样品10g（精确至0.001g），用蒸馏水定量地转移入250ml容量瓶中，加蒸馏水150ml，放在水浴上加热15分钟（温度不高于50℃6.4.2碱性酒石酸铜溶液的标定：准确吸取碱性酒石酸铜甲和乙液各5ml，置于250ml锥形三角瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加约9ml葡萄糖标准溶液，加热至沸（控制在2分钟内加热至沸），趁沸以每2秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液的蓝色刚好退去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值，按下式计算。式中：F——10ml碱性酒石酸铜溶液相称于葡萄糖的质量，mg；c——标准葡萄糖溶液的浓度，mg/ml；V——标定期消耗葡萄糖标准溶液的总体积，ml。标定次数123平均葡萄糖总体积VV平均=6.4.3（1）试样中还原糖的测定：a.粗滴：准确吸取碱性酒石酸铜甲和乙液各5ml，置于250ml锥形三角瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，加热至沸（控制在2分钟内加热至沸），趁沸以先快后慢的速度滴加样品溶液，滴定期要始终保持溶液呈沸腾状态。待溶液蓝色变浅时，每2秒1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好退去为终点，记录样品溶液消耗的体积。b.正式滴定：准确吸取碱性酒石酸铜甲和乙液各5ml，置于250ml锥形三角瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，从滴定管中加入比预测时样品溶液消耗总体积少1ml的样品溶液，加热使其在2分钟内沸腾，准确沸腾30秒钟，趁热以每2秒1滴的速度滴加样液，直至溶液的蓝色