细胞工程重点

细胞工程名词解释：细胞工程：是应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。植物组织培养：将植物组织在适当培养条件下诱导长成完整植株的技术。试管植物：植物组织培养再生的植物。器官发生：离体培养的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。细胞全能性：在多细胞生物每个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因，具有发育成完整个体的潜力。细胞脱分化：已有特定结构和功能的植物组织的细胞在一定条件下被诱导改变原有的发育途径，逐步失去原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞的过程。愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团。外植体：植物体上切取下来进行培养的部分组织或器官。体细胞胚（胚状体）：离体培养条件下，没有受精过程而形成的胚胎类似物。胚性细胞：细胞悬浮培养中，聚集成簇、成团的体积小而胞质致密细胞，具有成胚能力。原生质体：去除细胞壁后裸露的球形细胞。大量元素：植物需要量或含量较大的元素。如氮、硫、磷、钾、钙、镁。钾对酶有活化作用；钙在植物信号传导中有重要作用；镁是叶绿素的组成成分。微量元素：植物正常生长发育极少需要的元素。铁、锰、铜、锌、氯、硼、钼。这些元素对于蛋白或酶的生物活性十分重要。肌醇在糖类的相互转化、维生素和激素利用等方面具有促进作用，并能刺激细胞快速生长。腺嘌吟是合成细胞分裂素的前体物质之一。添加腺嘌吟能促进细胞合成分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成。植物激素包括：生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯等。生长素：是一类含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内涵激素。细胞分裂素：一类促进细胞分裂、诱导芽的形成，并促进其生长的植物激素。分裂素大多为嘌吟族衍生物，其生理作用主要是引起细胞分裂，诱导芽的形成和促进芽的生长。常使用的分裂素有6-苄氨基嘌吟（6-BA）、激动素（KT）、玉^米^^。富盐平衡培养液是常用的一种培养基。玻璃化：组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状、外观形态异常的现象，又称为过度水化现象。植物胚胎培养：对植物的胚及胚器官进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。成熟胚培养：子叶期至发育成熟的胚的培养。幼胚培养：早期原胚、球形期胚、心形期胚、鱼类期胚的培养。胚乳培养：处于细胞期的胚乳组织的离体培养。成熟的胚乳培养和未成熟胚乳培养可诱导产生愈伤组织或直接进行器官分化。胚珠培养：未受精或受精后的胚珠的离体培养。毛状根（发芽根）：是植株或组织、器官受到发根农杆菌感染后形成的类似头发一样的根组织。属于激素自养型。人工种子（合成种子）：将植物离体培养的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中类似种子的颗粒。看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来看护单核细胞，使其持续分裂和增值的一种培养方法。饲养层培养法：将处理过的无活性的或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂生长的方法。细胞系：以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一细胞群体。细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞固定化：将游离的细胞包埋在支持物内部或表面、培养液呈流动状态进行培养的一门技术。初级代谢产物：细胞通过初级代谢产生的维持细胞生命活动的必需物质。次级代谢产物：细胞通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物。如抗生素、激素、生物碱原生质体：植物细胞去除细胞壁后裸露的球形细胞。染色体工程：按照一定设计，有计划地消减或添加、替换同种或异种染色体从而达到定向改变遗传性状和选育新品种的一种技术。单倍体：细胞中含有正常体细胞一半染色体数的个体，即具有配子染色体组的个体。多倍体：体细胞中含有超过正常染色体组数的个体。同源多倍体：若多倍体的染色体来自同一物种或在原有染色体组的基础上加倍而成的个体。异源多倍体：染色组来源于不同物种的个体。转基因植物：将外源基因转入到植物细胞或组织中获得具有新的遗传性状的植物。基因改良植物：利用转基因技术实现植物品种改良，主要包括：抗虫害、抗除草剂、抗病毒、控制果实成熟、该变花型花色、抗环境压力、生产高品种产物等转基因植物。基因枪法（粒子轰击）：经过加速装置用表面附着着的DNA分子的金属微粒轰击植物细胞，将DNA直接射入植物细胞（不受受体种类的限制、简化质粒结构、快速简单转化效率高）。基因改良植物：利用转基因技术可以实现植物品种改良，主要包括抗虫害、抗除草剂、抗病毒、控制果实成熟、改变花形花色、抗环境压力、产生高品质产物等转基因植物。原代培养：在首次传代前的培养。传代培养：将原代培养的细胞继续转接培养的过程。有限细胞系：不能连续培养的细胞。连续细胞系：能够连续培养下去的细胞。杂交瘤技术：将骨髓瘤细胞与免疫动物的脾细胞融合，得到能够分泌抗体又能够在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的一种技术。杂交瘤技术在细胞融合技术的基础上发展起来的。抗原：进入动物体内对机体免疫系统产生刺激作用的外援物质，包括蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌。抗体：动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质影响的糖蛋白。多克隆抗体：血清中能够针对多种不同的抗原决定簇的单克隆抗体的混合物。单克隆抗体：经过免疫的哺乳类动物单一B淋巴细胞分泌的单一性抗体，具有特异性、同质性、针对一种抗原决定簇的抗体。胚胎工程：对动物早期胚胎或配子进行工程技术操作，获得所需要的成体动物的技术。体外受精：将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。体外受精动物也称试管动物。精子获能：精子获得穿透卵子透明带能力的过程。采用活体卵巢收集和屠宰后家畜卵巢收集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘-卵母细胞复合体。卵母细胞分为A、B、C、D四个等级，A级卵母细胞有三层以上卵丘细胞紧密包裹，胞质均匀；B级卵母细胞胞质均匀，卵丘细胞层数低于三层；C级是没有卵丘细胞包裹的卵母细胞；D级是死亡或退化的卵母细胞。体外受精一般只选用A、B卵母细胞。卵母细胞成熟的一些标志：发生泡破裂、染色体凝集、纺锤体的形成、极体排出、透明带软化、卵丘细胞扩散。胚胎移植（ET）：将发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未配种的'受体〃母畜输卵管或子宫的技术。体细胞克隆：是将动物体细胞经过抑制培养使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将核导入去核卵细胞，培育成早期胚胎移植至受体，妊娠产仔培育出与核供体一样的成体动物的一种细胞工程技术。转基因动物：在基因组内稳定地整个外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。乳腺生物反应器：将外源基因置于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，然后通过回收乳汁获得重要价值的生物活性蛋白的技术。干细胞：一类具有自我更新和分化潜能的细胞。分为：单能干细胞、多能干细胞、全能干细胞。ESC（胚胎干细胞）：从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能干细胞。成体干细胞：成体组织内最具有更新和进一步分化潜能的细胞。常见的成体干细胞：神经干细胞、骨髓造血干细胞、间质干细胞。组织工程：利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或器官再生的一门技术。组织工程三要素：种子细胞、支架材料、影响因子。问答/简答/填空：细胞工程主要应用：1动植物快速繁殖（主要技术有：植物组织培养、人工种子、体外受精动物、克隆动物）、2品种改良与新品种培育（细胞融合技术、单倍体变种、植物离体受精）3细胞工程生物制品、4组织工程。植物组织培养再生植株的途径（问答）：器官发生途径、体细胞胚发生途径。1正常再生植物f（花药培养）f外植体f先固体、后液体培养基f悬浮培养f形成胚状体f胚状体萌发形成小植株f正常再生植物2正常再生植物f取幼胚f离体胚胎培养f胚萌发f形成幼苗f形成小植株3正常再生植物f外植体f固体培养基f直接分化为根、芽外植体或单细胞经愈伤组织培养成成熟植株需要经过：1启动期（外植体细胞脱分化和分裂）、2愈伤组织诱导、3拟分生组织的形成、4器官原基和器官的形成（通过适宜的植物激素刺激：生长素、分裂素在离体植物器官分化调控中起关键作用）。器官发生的方式：先发芽后生根、先生根后发芽、同时生根发芽。生长素作用:对体细胞发生具有重要的调控作用。如：高浓度的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）能诱导胚性细胞的形成。分裂素作用：能促进细胞分裂、维持细胞活跃生长。体细胞胚发生的实质是细胞再分化，有以下途径：1器官外植体直接发生途径：属于离体培养条件下体细胞胚发生的直接途径。经过诱导期，胚胎发育期两阶段。2悬浮培养细胞发生途径：细胞悬浮培养中一般有两种细胞：自由分散的大而高度液泡化细胞，一般不具备胚胎发育发生能力；成簇、成团的体积小而胞质致密细胞，具有成胚能力，被称为胚性细胞团。3愈伤组织发生途径：诱导外植体形成愈伤组织；诱导愈伤组织胚性化；体细胞胚形成。4单细胞发生途径：通过花粉、花药培养为小抱子、大抱子诱导胚状体发生。5原生质体发生途径植物组织培养常用的有机物：糖类、氨基酸、维生素、醇类。生长素功能：1在细胞水平上刺激形成层细胞分裂；刺激枝的细胞伸长，抑制根细胞生长；促进木质部、韧皮部细胞分化，促进插条发根；调节愈伤组织的形态建成。2在器官和植株水平上，从幼苗到果实成熟都起作用。褐变：可分为酶促褐变与非酶促褐变，可以通过以下途径避免或缓解褐变的发生：1选择适宜的外植体、2选择适宜的培养条件、3细胞筛选和材料预处理、4使用抑制剂、5使用吸附剂。微生物污染针对内源菌污染可以采取以下防治措施：1改进外植体消毒方法；2反复检查培养物；3使用适当种类和浓度的抗生素。毛状根诱导方法：1）外植体接种法：取植物的叶片、茎段、叶柄等无菌外植体，与发根农杆菌共培养2——3天，将植物外植体移含有抗生素的选择性培养基上，经过多次继代培养产生毛状根。2）茎秆接种法：代植物种子发育为无菌苗，取茎尖继续培养，代生长到一定程度后，切取茎尖、叶片，留下茎秆和根部，在茎秆上割出伤口，将带有Ri质粒的发根农杆菌在伤口处和茎的顶部切口处，经过一定时间的培养可诱导产生毛状根。3）原生质体-农杆菌共培养法：将原生质体培养3-5天，加入发根农杆菌进行共培养，借助转化后的激素滋养型或T-DNA上的抗菌素标记筛选出转化成功的细胞，代分裂形成愈伤组织后，可在无激素培养基上产生毛状根。毛状根培养的例子：培养长春花毛状根生产长春花碱，紫草毛状根生产紫草宁，人参毛状根生产人参皂苷。毛状根培养的优点：1由Ri质粒转化的毛状根生长快、激素自养，培养时无需添加外源激素，容易培养；2毛状根分化程度高，产生次生代谢产物能力强，能大量合成某些悬浮培养细胞无法或很少合成的代谢物；3通过T-DNA改造，易于采用基因工程途径提高次级代谢产物产量。人工种子与天然种子相类似的结构：1人工种皮外层，保护胚状体中的水分丧失与防治外部力量的冲击；2人工胚乳，含有必须的营养成分与某些植物激素；3胚状体或芽。胚状体同步发育主要方法：抑制剂法、低温法、渗透压法、通气法、分离筛选法。人工种皮的制作一般采用聚氧乙烯，目前多采用海藻酸盐。植物单细胞分离方法有：酶解法、愈伤组织诱导法。悬浮细胞的分批培养生长曲线与微生物细胞生长基本相同，经历：延迟期、对数生长期、直线生长期、减缓期、平台期、衰亡期。一般在平台期前进行继代培养。植物细胞悬浮培养的生物反应器类型（并简述）：一般分为机械搅拌式、鼓泡式、气升式。1机械搅拌式：由罐体、搅拌桨、控温装置、气路、传感器等组成。依靠液体的轴向流动和径向流动进行充分搅拌和高效供氧，但对于细胞剪切力大。2气升式：由气升室、气降室、除气室、底部组成。培养液循环的动力源于气升室、气降室的气压差，比鼓泡式有更为均一的液体流动。3鼓泡式：是最为简单的气动式生物反应器，气体分布器一般位于反应器底部中央，通过排除气体使得液体形成无规律的涡流状态，由于培养过程中没有机械能消耗，适合培养对于剪切力敏感的细胞，但不适合高密度的和黏度较大的培养物。固定化细胞的活力鉴定：1染色法；2呼吸强度鉴定；3细胞生长和分解速率测定。适合于植物细胞固定化培养的生物反应器系统主要有：流化床生物反应器、填充床生物反应器。原生质体分离纯化的方法：1酶解法：常用的酶包括一一琼脂酶、果胶酶、纤维素酶。2原生质体纯化：过滤离心法、漂浮法、沉降法和漂浮法结合法经原生质体培养的植物再生一般经过细胞壁再生、细胞分裂成细胞团、愈伤组织（或胚状体、分化成芽和根、完整植株。转基因植物的受体：叶盘，原生质体，悬浮细胞，愈伤组织，活体，胚轴、茎尖、茎段。转基因的方法有：直接导入法、载体介导法、花粉管通道法、病毒感染法。动物细胞培养的特点：1、 动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。2、 动物细胞倍增时间长，生长缓慢。3、 培养过程需要量少，对机械搅拌或剪切力敏感。4、 动物细胞间主要以聚集体形式存在。5、 原代细胞一般繁殖50带代左右就退化死亡。6、 动物细胞对于营养要求很苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清7、 对于培养环境及其敏感，包括PH、溶解氧、温度、剪切力等8、 细菌、真菌、病毒、支原体均可导致动物细胞培养物的污染9、 绝大多数哺乳动物只有贴壁在固体或半固体的表面才能生长。贴附型细胞类型（贴壁细胞）：1成纤维型细胞：细胞外形与体内成纤维细胞相似，呈梭形或不规则形。贴壁后呈长梭形，圆形胞核位于中央，胞质外伸出2——3个长短不一突起，生长呈放射状、旋涡走向。人胚肺细胞2上皮型细胞：细胞外形类似于上皮细胞，扁平状，性状较规则，贴壁后呈三角形及不规则扁平多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此毗邻紧密形成单层细胞。皮肤的表皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞。3游走型细胞：具有类似巨噬细胞样特征，在支持物上分散生长，一般不连接成片，形成群落；胞质常生出伪足或突起；在培养皿中的生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快方向不规则；胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞。4多形性细胞：形态上不规则的细胞，一般分为胞体和胞突两部分。神经元和神经胶质细胞。非贴附型细胞类型（非贴壁细胞）：血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系。形态特点为 始终为球形。细胞培养最适PH一般在7.2一7.4；CO2有调节PH的作用。培养基包括：天然培养基、无血清培养基、合成培养基。细胞消化液常用——胰蛋白酶溶液。动物细胞培养过程生长曲线：原代培养期、传代期、衰退期。原代培养中组织块培养与组织消化培养的区别：1前者使用机械剪切分散细胞组织，后者使用酶解法分散细胞团。2前者主要针对软组织，后者针对细胞间质较少的软组织。3组织块培养对于组织细胞的损伤相对于酶解法小，可以这对于生长条件苛刻，不太适用于敏感脆弱的细胞。细胞冻存流程：1将细胞消化分散，使用冻存液（含有10%甘油或0.5%DMSO的血清）将细胞悬液稀释为2〜5百万个/mL，稀释时细胞悬液与冻存液配比为1:9,。2将含有细胞的冻存液转移至冻存管中，并无菌封口。3将冻存管放入满冻机内，按照每分钟下降TC缓慢冷冻。4冻结好的安甑放入CO2低温冰柜或液氮罐中。5如需复苏则从冷冻机中取出后立刻放入37。。中水浴，融化。常用的细胞株：BHK-21细胞（从幼地鼠肾脏分离）、WJ-38细胞（从女性高加索人胚肺组织中获得的2倍体细胞）。转基因的方法有：1物理：电穿孔法（最为简单有效的方法）。2化学：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙-DNA共沉淀、脂质体载体包埋法。3生物：由病毒介导的基因转移。常用的病毒载体为逆转录病毒载体、DNA病毒载体。逆转录病毒原理：进入细胞后，RNA首先编码出反转录酶，将病毒RNA反转录为双链DNA分子，此DNA通过某种机制整合到宿主DNA中，从而获得有效、稳定的转染。逆转录病毒特点：受体细胞可以表达由病毒介导的外源基因，而不产生病毒，但是有诱导产生免疫的存在，也有安全隐患的存在。单克隆抗体的杂交瘤制备步骤：动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化培养、单克隆抗体的大量生产。1、 动物免疫：目的是产生足够多的能够识别目的抗原的B淋巴细胞。一般需要经过初次免疫、二次免疫、加强免疫三过程。2、 骨髓瘤突变缺陷细胞株的培养和选择：选择与免疫动物同意品系的骨髓瘤细胞，提高融合效率。为促进杂交瘤细胞生长，使用饲养层细胞培养V一用肉汤刺激小鼠腹腔中的巨噬细胞作为饲养细胞。3、 HAT培养基筛选：细胞融合前必须对骨髓瘤细胞进行HAT选择培养基敏感性实验，不敏感的不用于细胞融合。4、 细胞融合与杂交瘤筛选5、 杂交瘤细胞的克隆化培养6、 单克隆抗体制备动物免疫及免疫脾细胞的制备：1体外法：直接分离动物淋巴细胞，加适当浓度抗原，3~4d后收集淋巴细胞。2体内法：将抗原直接注入动物体内，3~4d后在无菌条件下取出脾或淋巴结制成细胞悬液。一般经过初次免疫、第二次免疫、加强免疫三个过程。骨髓瘤细胞的培养采用一般的动物细胞培养液（RPMI1640培养基）体外受精一般经历以下步骤：1