活力测定细胞复苏

活力测定细胞复苏第1页/共21页一、实验目的：1．掌握测定细胞活力的方法。第2页/共21页二、实验原理

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。第3页/共21页三、实验材料仪器、材料与试剂1．仪器：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、分光光度计。2．材料：细胞悬液。3．试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇第4页/共21页四、操作步骤1．细胞计数①将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。②将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。③静置3分钟。第5页/共21页④计数：在低倍镜下计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。数出计数板上计数室四角四大格中的细胞数，如细胞压在格线上时，数上不数下，数左不数右。第6页/共21页⑤细胞浓度计算：四大格的细胞总数除以4，得出平均每大格的细胞数，每大格的容积为0.1mm3，因此，不同稀释倍数细胞悬液的细胞浓度可用下式计算：细胞浓度（细胞数／ml）＝（四大格的细胞数／4）ⅹ10000ⅹ稀释倍数注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液第7页/共21页2．细胞活力测定

台盼蓝活力测定机理：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。第8页/共21页①将一定浓度的细胞悬液与0.4%台盼兰以9:1混合。②染色2一3分钟。③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。第9页/共21页3．MTT法测细胞相对数和相对活力

活细胞中的脱氢酶能将MTT还原成不溶于水的蓝紫色产物（甲臜，Formazan)，并沉淀在细胞中，其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。而死细胞没有这种功能。酸化异丙醇能溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的Formazan量成正比，最后用酶标仪测定OD值。第10页/共21页①细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。②沉淀加入0.5－1mlMTT，吹打成悬液。③37℃下保温2小时。④加入4-5ml酸化异丙醇（定容）。打匀。⑤1000rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。第11页/共21页细胞的冻存和复苏第12页/共21页一、实验目的掌握细胞冻存的方法。第13页/共21页二、实验原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、蛋白变性等，引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。第14页/共21页影响冷冻效果的因素1、冷冻速率细胞冷至-10--15℃之间时，细胞外溶液先出现结冰，而细胞细胞内仍保持未结冰状态、细胞内未结冰的水分子会向细胞外流动。冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内溶质浓度增高、细胞不发生结冰。冷冻速度快，细胞内水分没足够时间外渗，会发生结冰。第15页/共21页2、冷冻保存温度液氮（-196℃）是最佳保存温度。3、复温速度越快越好，37℃水浴中，1-2min完成复温。4、冷冻保护剂保护细胞免受冷冻损伤的物质，常用甲亚砜（DMSO）和甘油。第16页/共21页三、实验材料1．仪器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮罐，离心机，水浴锅，微量加样器等2．材料：冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管等。3．试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）等。第17页/共21页四、操作步骤1．冻存

①胰酶消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。②1000rpm离心5分钟，弃上清液。③沉淀加含保护液的培养基（培养基：DMSO=1:1），计数，调整至5×106/ml左右。④将悬液分至冻存管中，每管1ml。

第18页/共21页⑤将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。⑥贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。⑦按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（-20℃）（1小时）→气态氮（过夜）→液氮。注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。第19页/共21页2．复苏①从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。②打开冻存管，将细胞悬液吸到离