PCR引物的设计与实验操作技巧课件

微生物基因工程李刚副教授教学内容一、PCR引物的设计与实验操作技巧；

二、基因组文库的建立与筛选；

三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中的应用；

四、原核表达系统的选择和高效表达策略；五、真核表达系统的选择和高效表达策略。一、PCR引物的设计与实验操作技巧聚合酶链式反应、分子克隆及DNA序列分析这三大类实验方法几乎构成了现代分子生物学的实验工作的基础。而三者中，PCR方法在理论上出现最早，在实践中应用得最广泛。PCR引物设计的几条原则：①引物长度一般引物长度为18-30碱基就足够了。特殊情况下（比如Tm值或GC含量不合适）可以进一步延长到50-60bp长度。但超过60bp的引物长度比较少见。原因一是超过60bp长度的引物比较难以合成，因此合成价格大幅度增加。另外长引物在合成的时候出错率也显著增加。上下游引物的长度应该基本相等，最好相差不要超过3bp。2.碱基组成G＋C含量应在40％到60％之间，4种碱基要在引物中分配均匀。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。4．上下游引物的互补性一个引物的3‘端不允许结合到另一个引物的任何位点上。因为在PCR中引物的浓度往往是比较高，所以即使引物间微弱的互补，都会导致引物间形成杂交，随后是引物二聚体的形成和扩增。如果引物二聚体在PCR早期形成，它将和DNA聚合酶、引物及核苷酸竞争进而抑制靶DNA的扩增。精心进行引物设计，应用热启动PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶（如：AmpliGold，Perkin－Elmer）都可以避免引物二聚体的形成。当在一个PCR中应用多对引物时，请注意检查任何一个3’末端都不能和其他任何引物互补。5.解链温度（Tm）解链温度（Tm）：也称熔化温度。计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5C。扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10C。这些特性保证了扩增产物在每个PCR循环可有效地变性。为什么要计算引物的解链温度因为PCR的进行需要确定三个温度。第一，变性温度，变性往往是在94C－95C进行，这是TaqDNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不致受到过多损失时所耐受的最高温度；第二，退火温度。也称复性温度。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度（Tm值）低3－5C的条件下进行。第三，延伸温度。对TaqDNA聚合酶来说最适温度一般为72C－78C。其中，变性温度和延伸温度对于每个PCR反应来说几乎都是固定的，唯一不同的就是退火温度。而退火温度与引物的解链温度密切相关，因此必须计算出引物的解链温度后才能确定PCR的退火温度。6.3‘末端

3’末端的性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C，不能为A。然而，并不推荐使用3’端有NNCG或NNGC序列的引物，因为末端GC碱基高的自由能可以促进发夹结构的形成，还可能产生引物二聚体。7．向引物的5‘端添加限制性酶切位点，噬菌体启动子等序列有用而又不与靶DNA序列互补的序列一般加到引物的5’末端。一般来说，这些序列的存在不会显著地影响寡核苷酸和靶DNA之间的复性。这些附加序列包括噬菌体启动子和GC夹子。限制性酶切位点是一个特殊情况。因为位于DNA分子5‘末端的限制性酶切位点的切割效率比较低，所以引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。保护碱基的确定保护碱基的确定不是随意的，通常每一种限制性内切酶都有自己最佳的保护碱基。每一种限制性内切酶与其对应的最佳保护碱基请到NEB公司网站或互联网上查询。PCR设计软件推荐PrimerPremier5WDNASISOligo7

PCR高保真酶推荐PE公司（ABI）Parken－ElmerDNA聚合酶，TakaRa公司的PrimeSTARHSPolymerase，ToYoBo公司的Kod－PlusPolymerase。PCR产物的克隆

在许多研究中,需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。此时,所用PCR循环数应尽量小,以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。1.平末端连接：由于TaqDNA聚合酶往往在PCR产物3'端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR产物前,可用Klenow片段或T4DNA聚合酶处理补平末端。2.在PCR产物克隆载体尾部加dT或ddT：TaqDNA聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3'端只加上一个ddTTP,而其5'端所含的磷酸基团可与PCR产物的3'端OH连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复.目前很多公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3'-T的T-Vector。3.粘性末端连接：利用引物中附加在5'端的限制酶位点,直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接,产生重组DNA.如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后可定向克隆到载体中。模板最容易出现的问题一、模板含有杂质：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定,不宜随意更改。

二、模板发生变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。通常模板发生变异的主要原因是模板切胶回收时间过长（一般应控制在1分钟以内）或无意中将模板置于超净工作台中灭菌所致。

PCR引物常见的问题引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

DNA聚合酶的问题酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时PCR失败是由于忘加了酶。

PCR反应体积通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。如果不愿重新摸索条件，一个最简单可行的办法是按照小体积的条件多做几管，最后将PCR产物汇集在一起。

另外，PCR管有普通管和薄壁管（thinwallPCRtubes

）之分。普通管和薄壁管的热传导效率是不同的。热盖与非热盖PCR仪早期的PCR仪均为非热盖，因此每个PCR反应管中需要加入无菌石蜡油，以防止溶液的蒸发。现在的PCR仪大部分都有热盖（及顶部加热器），会阻止溶液的蒸发，因此PCR反应管中不需加入石蜡油了。非特异性扩增带出现的对策（一）其对策有：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；适当提高退火温度或采用二温度点法(98℃变性，65℃左右退火与延伸.如TaKaRa公司的PrimeSTARHSDNAPolymerase就是采用的二温度点法)。

非特异性扩增带出现的对策（二）采用热启动PCR：把PCR混合物在显著低于Tm值的温度下作哪怕短暂的保温，也可能产生引物二聚体和非特异性配对。热启动PCR则可以大大减少这些麻烦。其目标是在第一个循环中等温度升到超过反应物的Tm值后才允许反应中的一两种关键成分进入反应。例如在覆盖有矿物油的小试验中，所有反应管的一种公共成分（如Taq酶）可以先不加，而到第一个循环的变性阶段温度超过80℃以后再加。最近有一种热启动的方法是在加入TaqDNA聚合酶前先在管中加入其单克隆抗体（Clonetech公司的TaqStartAntibody，或者ToYoBo公司的KodPlusDNA聚合酶），在温度升高到将中和抗体变性失活之前，抗体阻遏聚合酶的活性，防止反应开始。非特异性扩增带出现的对策（三）嵌套式和半嵌套式PCR对于减少或消除不需要的产物同时提高灵敏度经常是很成功的。首先在常规条件下用第一套跨越目的DNA片段的引物扩增，假象产物经常会与引物中的一条或两条配对，但其内部却是无关序列。接着对一部分反应物－产物混合物进行新一轮扩增，采用的引物与第一对引物内侧的序列配对，在这一轮扩增中只有真正的产物被扩增。这种办法即使在目的产物开始用EB染色检测不到而且有假象带时也常常获得成功。半嵌套式PCR，只第二条引物在目的片段一端的内侧，也同样有效。在基因步行或企图进行5‘或3’端RACE时，由于只有一条引物内部的序列是已知的，经常需要作这种变动。采用嵌套式PCR方法，第一、二轮扩增在第20个循环左右终止而不是象通常的在第30－35个循环终止会获得更好的结果，这样做减少了产生不需要的高分子量带和成片产物的机会。嵌套式PCR极端敏感，在106基因组DNA背景中一个拷贝的病毒基因也能检测到。出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶；减少dNTP的浓度；适当降低Mg2+浓度；增加模板量，减少循环次数。

进行多轮PCR时，PCR产物

成片的原因?进行多轮PCR时，如果下一轮PCR反应的起始模板量太大，即使PCR条件是正常的，产物成片现象也可能会出现。总的规则是如果上一轮PCR产物在凝胶上见得到条带，只能用1l上一轮PCR产物的1：104到1：105稀释物作为模板进行下一轮PCR。另外对上一轮PCR产物稀释也降低了下一轮PCR产物出错的概率。很少或没有检测到产物的原因如果已经调整了Mg2＋浓度、缓冲液的pH值和循环产物，而且也增加了循环数，尝试过了较低的退化温度和TDPCR，但在EB染色的凝胶上还是看不到产物（聚丙烯酰胺凝胶比琼脂糖凝胶要敏感一些），而阳性对照表明试剂没有问题，下一步该怎么办？延长起始的变性时间和（或）提高温度能增加模板DNA完全变性的可能，以提供最大数量的引物配对位点。这一可选步骤的标准条件是95C变性5分钟，有可能扩增发生了，只是效率不高，如果这样，可通过对干凝胶或印迹的杂交来检测产物。用同一套引物或者最好用嵌套式引物进行第二次扩增