第九章植物花药和花粉培养

花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。

图9-2小麦花药小孢子胚胎发生（引自陈耀锋，1998）9.1植物花药和花粉培养的概念

现在是1页\一共有41页\编辑于星期四花药中（或花粉）小孢子的雄核发育，产生植物单倍体（haploid），进而可以通过染色体加倍产生加倍单倍体（doublehaploid，DH）。双倍体植株单倍体胚单倍体植株现在是2页\一共有41页\编辑于星期四两者的异同点相同点：培养目的相同，均获得小孢子植株。不同点：（1）花药培养离体操作技术简单，而且，药壁组织有时可作为条件因子促进小孢子的发育。辣椒花药吊竹花粉粒现在是3页\一共有41页\编辑于星期四花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。（2）花药培养属于组织培养；而花粉培养属于细胞培养。辣椒花药吊竹花粉粒现在是4页\一共有41页\编辑于星期四9.2.1花药培养

1）取材

镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。2）预处理

低温（接种前3~20℃或接种后6~10℃

）；γ—射线和激光；高温预处理

（接种后32~35℃）；等方法

9.2花药和花粉培养方法现在是5页\一共有41页\编辑于星期四3）消毒70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。4）培养固体、液体与条件培养。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。现在是6页\一共有41页\编辑于星期四

图9-3小麦花药愈伤组织（左）及芽、根的分化（右）（引自陈耀锋，2002）

图9-2小麦花药小孢子胚胎发生（引自陈耀锋，1998）现在是7页\一共有41页\编辑于星期四与花药组织培养相比，花粉培养具有以下优点：花药培养产生的植株并不都是起源于花粉，容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生的植株中会出现不同倍性的个体，所以花药培养在诱导单倍体方面有一定的局限性，而分离的花粉粒培养可以克服这一不足。由于去除了药壁和其它连接组织的干扰，因此能更好地调节控制雄核发育的各种因子，而且能直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程。9.2.2花粉培养现在是8页\一共有41页\编辑于星期四花粉是真正的单细胞单倍体，花粉群体的所有小孢子在培养条件下均能匀质地接受各种化学的、物理的因子处理，是突变体筛选及外源基因导入研究的有用材料，对育种有很大的意义。花粉群体大，一个花药中就有成千上万个小孢子，从花粉培养能得到更多的花粉植株。七叶树花粉粒现在是9页\一共有41页\编辑于星期四1）自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)

将花药接种在固体或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2）机械游离

挤压法在烧杯或研钵中用玻棒等挤压花药，将花粉挤出后收集培养。磁搅拌法用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；9.2.2.1花粉的分离与纯化

现在是10页\一共有41页\编辑于星期四超速旋切法

通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。4）甘露醇处理法（0.3mol/L甘露醇中25℃暗培养3～4d

）5）小孢子纯化

对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子。现在是11页\一共有41页\编辑于星期四梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）现在是12页\一共有41页\编辑于星期四9.3.2.2花粉培养方式

平板培养

花粉置琼脂固化培养基上培养。液体培养

花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。双层培养花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。预培养法将花药在培养基上先培养3～4d，再将花粉分离出来小三角瓶中作薄层培养。现在是13页\一共有41页\编辑于星期四微室培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养条件培养基培养

利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。看护培养

利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。现在是14页\一共有41页\编辑于星期四看护培养图解现在是15页\一共有41页\编辑于星期四9.4花药培养一步成苗

通常花药培养一般是采用脱分化、再分化和生根壮苗等几个培养程序，称为多级成苗。一次成苗又称一步成苗或直接成苗，是指离体培养的花药组织的花粉细胞在一种培养基上同时完成脱分化和再分化过程，直接分化出完整植株的培养方法。

图9-4小麦花药培养一步成苗现在是16页\一共有41页\编辑于星期四与多级成苗相比，一步成苗有以下几个优点：1）

一步成苗简化了培养程序，降低了培养成本，加快了成苗速度。2）一步成苗提高了花药培养效率。（提高绿苗率，主要通过胚状体成苗）3）一步成苗中绿苗的质量明显提高。（生长快而健壮）4）一步成苗简化了培养过程，减少了愈伤组织形成过程中的细胞变异，有效降低了白化苗产生频率。现在是17页\一共有41页\编辑于星期四白化苗的重要特性:

生殖生长和雌蕊的发育均不正常，不能完成有性世代和获得白化苗的种子，无法用这种方法证明它是否是一种可遗传性状。在花粉白化苗的细胞中，常发现有微核存在。9.5白化苗现象现在是18页\一共有41页\编辑于星期四白化苗叶肉细胞的细胞质中，无正常发育的成熟叶绿体，只存在前质体到近乎正常叶绿体的各种形态的质体。花粉白化苗和绿苗在蛋白质、RNA和DNA的组成上有明显差异。花粉植株的白化现象是不可逆的，通过改变营养成分或其它条件都无法使白苗转绿。现在是19页\一共有41页\编辑于星期四9.5.1白化苗产生的影响因素及机理1）内因

供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。2）外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3）机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外无性系变异也可能是原因之一。现在是20页\一共有41页\编辑于星期四9.5.2白化苗的控制

通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。现在是21页\一共有41页\编辑于星期四

1)胚状体发育途径

小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。9.6花粉植株形态发生方式a)球形胚d)鱼雷形胚芸苔属小孢子培养现在是22页\一共有41页\编辑于星期四烟草花药培养烟草部分花药通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养通过胚状体途径再生形成小植株现在是23页\一共有41页\编辑于星期四2)愈伤组织发育途径

小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。水稻花药培养愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株接种在平板上的水稻花药部分花药产生愈伤组织现在是24页\一共有41页\编辑于星期四9.7.1倍性鉴定(1)染色体直接计数法通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。(2)间接鉴定扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）

主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。9.7单倍体植株鉴定和染色体加倍现在是25页\一共有41页\编辑于星期四

细胞形态学鉴定法

叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。

植株形态学鉴定法

单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。现在是26页\一共有41页\编辑于星期四杂交鉴定法

自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。分子标记鉴定

包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）现在是27页\一共有41页\编辑于星期四9.7.2单倍体植株的染色体加倍浸入法即在花粉苗移前、后用秋水仙素等化学试剂进行浸泡根、茎、生长点或分蘖节进行染色体加倍的方法。对于健壮的植株应采用简易的浸根法，对生长较弱的植株适宜于用先移栽后加倍处理的刨根法。培养过程加倍法脱分化期培养基中加入低浓度秋水仙素加倍，加倍效果都不很理想在继代培养基中加入秋水仙素是加倍处理另一途径。现在是28页\一共有41页\编辑于星期四注射法

禾谷类作物花培单倍体苗采用分蘖节注射法可以得到良好的加倍效果。小麦单倍体苗在分蘖前用0.05%的秋水仙素+1.5%的二甲基亚砜注射分蘖节，注射在清晨8～10时进行，共三次，每隔一天注射一次，每次用量25μL，这一加倍方法的加倍成功率可达到40%以上，最高可达68％。生长锥处理法双子叶植物多用此种加倍方法，可用涂布、滴下、带药棉球处理法进行加倍。现在是29页\一共有41页\编辑于星期四9.7.2染色体加倍（为什么要进行加倍？）9.7.2.1茎段培养

将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。现在是30页\一共有41页\编辑于星期四有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。1)秋水仙素诱导 （1）浸入法

无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株、根、茎、生长点或分蘖节进行染色体加倍的方法。（2）生长锥处理双子叶植物多用此种加倍方法，可用涂布、滴下、带药棉球处理（顶芽或腋芽）法进行加倍。9.7.2.2化学试剂诱变

现在是31页\一共有41页\编辑于星期四（3）培养过程加倍法脱分化期培养基中加入低浓度秋水仙素加倍，加倍效果都不很理想在继代培养基中加入秋水仙素是加倍处理另一途径。（4）注射法

禾谷类作物花培单倍体苗采用分蘖节注射法可以得到良好的加倍效果。这一加倍方法的加倍成功率可达到40%以上，最高可达68％。2)除草剂诱导

（毒性小，引起植株的变异几率小）现在是32页\一共有41页\编辑于星期四花药和花粉培养基本流程：预处理花药（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株。选择合适的供体植株（F1？）倍性鉴定或染色体加倍现在是33页\一共有41页\编辑于星期四9.2花药或花粉培养的意义：供体植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株DH（2n）一年内获得纯系9.2.1作物育种（1）缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。现在是34页\一共有41页\编辑于星期四例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株常规方法：AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。（2）提高了目标基因型的选择效率

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb

Aabbab aAbB aabB aAbb aabb现在是35页\一共有41页\编辑于星期四二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法：AAbb出现的概率为1/4。

单倍体

二倍体

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供体亲本AaBb花培现在是36页\一共有41页\编辑于星期四诱变育种中的作用植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。9.2.2物种进化研究可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。