质粒提取方法课件

质粒三种提取方法的比较基因工程原理与技术实验部分：质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。

在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(OpencircularDNA,简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(LinearDNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。实验目的：1、学会小量制备质粒DNA的碱裂解方法、煮沸法、小量一步提取法这三种质粒DNA的提取方法。2、三种方法的比较，能够根据不同的实验目的选择合适的方法。闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；DNA双链变性DNA单链复性强碱中性染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性煮沸法：将细菌悬浮于含TritonX-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:1、培养细菌使质粒扩增

2、收集和裂解细胞

3、分离和纯化质粒DNA材料、设备及试剂一、材料

含卡那酶素的E.coliDH5α，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。

二、设备

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。三、试剂

1、LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。

2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。

3、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成50mg/ml水溶液,-20℃保存备用。

4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。

5、3mol/lNaAc(pH5.2)：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容至100ml,分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。

6、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(临用前用5-10mol/LNaOH母液稀释)，1％SDS。

8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。操作步骤

一、细菌的培养和收集

将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50μg/mlAmp)中,37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基(含50μg/mlKan)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。

二、质粒DNA少量快速提取

质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。

（一）、煮沸法将振荡过夜培养的细菌1.5ml

，于8000r/min离心1min，弃上清液。将沉淀回溶于350μLSTET(0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)，5%TritonX-100。)中。加入25μL溶菌酶(10mg/mL)，放入沸水中40s，立即于10000r/min离心10min。吸出上清移至另一个Eppendolf

管中或用已灭菌的牙签小心地将沉淀去除，加入40μL2.5mol/LNaAc（PH5.2）和420μL冰冻的异丙醇，振荡混匀，室温放置5min。

12000g，离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗涤两次，然后将离心管倒扣在吸水纸上，使尽量干燥。用20μL无菌水溶解沉淀，于－20℃冻存试验步骤：（二）、碱裂解法

1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下10000rpm离心5min。

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。

3、菌体沉淀重悬浮于150μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。

4、加入新配制的溶液Ⅱ300μl,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。

5、加入227μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。

6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),颠倒混匀,4℃下12000g离心5分钟，重复一次。

7、将水相移入干净eppendorf管中,加入0.6-1倍体积的异丙醇,颠倒混匀静置10分钟，然后12000g离心10分钟。

8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入100ul70％乙醇洗沉淀两次。

9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。

10、将沉淀溶于20-50μl无菌水中，储于-20℃冰箱中。

取0.5ml细菌过夜培养物，置1.5ml的Eppendolf管中加入0.5ml的氯仿：异戊醇，用振荡器最大速度振荡1min，充分混匀。12000g，离心5min，取上清移至另一个Eppendolf管中，加入500µl异丙醇混匀，立即12000g，