蛋白质化学(李信)

第四章：蛋白质的结构与功能第一节：蛋白质一.什么是蛋白质?

蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。Whatareproteins?

分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。催化作用高效专一地催化机体内几乎所有的反应酶运输作用专一运输各种小分子和离子如血红蛋白调节作用调节机体代谢活动如胰岛素、钙调蛋白、阻遏蛋白运动作用负责机体的运动如肌动蛋白、肌球蛋白防御作用防御异体侵入机体如免疫球蛋白、病毒外壳蛋白营养作用作为氨基酸的贮库，用于生长发育所需

或某些物质与蛋白质结合而被贮存如卵清蛋白、酪蛋白、麦醇溶蛋白、铁蛋白结构蛋白

作为构建机体某部分的材料如a-角蛋白、胶原蛋白二.蛋白质在机体中的重要作用Whatdoproteinsdo?

三.蛋白质的化学组成C、H、O、N，大多含有S有的还含有P、Fe、I、Cu、Mo、Zn1.元素组成各元素的百分比对于大多数蛋白质都较相似，其中N约占16%

。因此可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋白质的含量，1克氮就相当于6.25克蛋白质，（凯氏定氮法）。

2.蛋白质的基本结构单元蛋白质的基本结构单元是氨基酸aminoacid多个氨基酸首尾连结形成长而不分支的多聚物——多肽链多肽链再折叠卷曲，形成蛋白质第二节：氨基酸组成蛋白质的氨基酸都为

a-氨基酸（除Pro外）C酸氨HH2NCOOHR不同的aa在于

R基团的不同组成蛋白质的氨基酸都为

L型（除Gly外）

非极性氨基酸(8)

极性氨基酸

不带电的极性氨基酸(7)带负电酸性氨基酸(2)带正电碱性氨基酸(3)组成蛋白质的氨基酸共有20种I非极性氨基酸

丙氨酸 AlaCOOHCH3CHNH2

CHCHCOOHNH2

CH3CH3

缬氨酸 ValI非极性氨基酸COOHCH2CHNH2

CH3CH3CH亮氨酸 Leu异亮氨酸 IleCOOHCHNH2

CHCH3CH2CH3

脯氨酸 ProCOOHCHNHCH2CH2CH2I非极性氨基酸

苯丙氨酸 PheCOOHCHNH2

CH2COOHCH2CHNH2

色氨酸 TrpN

H

甲硫氨酸 MetCOOHCHNH2

CH2CH2SCH3组成蛋白质的氨基酸共有20种不同的aa在于

R基团的不同非极性氨基酸（8）

具有芳香环吲哚环色氨酸亚氨基II非解离的极性氨基酸

甘氨酸 GlyCOOHCHNH2HCHCOOHCHNH2

苏氨酸 ThrCH3HO

丝氨酸 SerCOOHCHNH2

CH2HO半胱氨酸 CysCOOHCHNH2

CH2HSII非解离的极性氨基酸

酪氨酸 TyrCOOHCHNH2CH2HO

天冬酰胺 AsnCOOHCHNH2

CH2COH2NCOOHCHNH2

谷氨酰胺 GlnCH2COH2NCH2III酸性氨基酸

天冬氨酸 AspCOOHCHNH2

CH2COHOCOOHCHNH2

谷氨酸 GluCH2COHOCH2IV碱性氨基酸(CH2)4

赖氨酸 LysCOOHCHNH2H2N

精氨酸 ArgCOOHCHNH2

(CH2)3NHCNHH2NCOOHCHNH2

组氨酸 HisCH2NHN脂肪族氨基酸杂环氨基酸芳香族氨基酸Phe、Tyr、TrpPro、HisAla、Val、Leu等

1.由R基团的性质人类自身能合成

非必需氨基酸

必需氨基酸

人类自身不能合成或不能足量合成，必须依赖食物供给。LysValLeuIleMetPheThrTrpGlyAlaSerTyrCysProAsnAspGluGlnArgHis2.由aa的营养需求几种特殊氨基酸

脯氨酸proline（亚氨基酸）Specificaminoacids半胱氨酸+胱氨酸二硫键-HH(Cysteine)通常是常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸三.稀有氨基酸1.稀有的蛋白质氨基酸以游离或结合态存在于细胞或组织中，大部分是常见氨基酸的衍生物或异构型。如存在于细菌细胞壁肽聚糖内的D-谷氨酸和D-丙氨酸、花生中的g-亚甲基谷氨酸、甘蔗中的b-氨基丁酸，刀豆中的刀豆氨酸等。2.非蛋白质氨基酸鸟氨酸(Orn)瓜氨酸氨基酸同时含有氨基和羧基：氨基具有碱性，羧基具有酸性四.

氨基酸的理化性质1.两性性质甘氨酸的解离曲线滴定曲线两性性质和等电点在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点，用pI表示(isoelectricpoint,pI)。pI是氨基酸的特征常数等电点等电点的计算例Gly的pI计算－H+＋H+NH2—CH2

—COO－Gly－＋NH3—CH2

—COO－Gly±

＋NH3—CH2

—COOHGly＋pI=1/2(pK1'+pK2')－H+＋H+K1'K2'K1'、K2'分别代表COOH和NH3＋的表观解离常数。可以从滴定曲线中求得。等电点的计算例Lys的pI计算pI=1/2(pK2'+pK3')溶液pH值增大COOHCH－NH3(CH2)4NH3＋＋Lys＋＋COO－CH－NH2(CH2)4NH2Lys－COO－CH－NH3(CH2)4NH3＋＋Lys＋－H+＋H+Lys±COO－CH－NH2(CH2)4NH3＋－H+＋H+－H+＋H+K1'K2'K3'例Glu的解离pI=1/2(pK1'+pK2')等电点的计算3种碱性氨基酸

等电点的计算公式pI=1/2(pK中+pK大)其余17中氨基酸

等电点的计算公式pI=1/2(pK小+pK中)pH>pI带负电，移向正极pH<pI带正电，移向负极pH=pI不带电，不移动结论除Gly之外，其余蛋白质氨基酸都有手性碳原子，都具有旋光性。旋光性质2.光学性质Trp、Tyr、Phe含芳香环共轭双键系统，最大吸收峰分别在

279nm、278nm、259nm。紫外吸收2.光学性质茚三酮反应还原性茚三酮OOOHH＋NH3＋CO2＋RCHO水合茚三酮＋RCH－COOHNH2OOO＋2NH3＋OOOHHOOOO＋NH4NO＋3H2O蓝紫色化合物OO反应分2步：茚三酮反应常用于aa的定性和定量分析3.重要的化学性质茚三酮反应在酸性条件下，氨基酸与茚三酮共热，生成蓝紫色化合物Pro的茚三酮反应呈黄色Sanger反应在弱碱溶液中，氨基酸的α-氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB)反应，生成黄色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA）。DNFB＋O2NNO2FH2NCHCOOHR

DNP-氨基酸O2NNO2HNCHCOOHR＋HF此反应最初被Sanger用于测定肽链N-端氨基酸Edman反应NCS＋40℃，弱碱NCNHRCHCOS40℃，H+、硝基甲烷COOHH2NCHRPITC异硫氰酸苯酯PTC-氨基酸苯氨基硫甲酰氨基酸PTH-氨基酸苯乙内酰硫脲氨基酸HNCNHRCHCOOHS可用层析法鉴定出aa的种类Edman反应此反应即是目前“蛋白质顺序测定”的设计原理Edman反应此反应即是目前“蛋白质顺序测定”的设计原理4、氨基酸分析分配层析法：分配系数Kd=CACBCA：一种物质在A相（流动相）中的浓度CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度原理：主要根据被分析的样品（如aa混合物）在两种互不相溶的两相中分配系数的不同而达到分离的目的，纸层析单向纸层析图Rf值

洗脱液样品填充物分部收集玻璃柱离子交换层析法1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用第三节：肽（peptide）一.肽的定义一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基脱去一分子水而形成酰胺键，这个键称为肽键（peptidebond），产生的化合物叫做肽（peptide）。二个氨基酸形成的肽称作二肽,三个氨基酸形成的肽称作三肽；……余类推。寡肽（oligopeptide）：aa<10个多肽（polypeptide）：aa>10个肽平面Peptidebondplane二.肽的结构无分枝的长链由“N-C-C”单元的周期性连接，构成多肽链的主链；氨基酸残基的R基团连接在主链的Ca上，形成多肽链的侧链。具有方向性。两个末端分别为N端(氨基端)和C端(羧基端)。

肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。

1、中文表示法：

从肽链的N端开始，对氨基酸残基逐一命名，残基称氨酰

三.

肽的表示法2、三字母表示法：

aa1-aa2-aa3-aa4-……aa1.aa2.aa3.aa4.……

3、单字母表示法：

ABCD……四.多肽的理化性质其等电点是在所有可解离的基团的净电荷为0时的状态。

肽链的一端含有一个游离的-氨基，另一端含有一个游离的-羧基，加上部分氨基酸可解离的R基团，因而与氨基酸一样具有两性解质的性质。（1）双缩脲反应

肽键的紫外吸收：210～230nm双缩脲＋碱性CuSO4溶液紫色肽的化学性质与氨基酸相似，但肽有与氨基酸不同的特殊反应：双缩脲反应

五.重要肽1、谷胱甘肽还原性谷胱甘肽（reducedglutathione）是存在于动植物细胞中的一种非常重要的三肽。它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。谷氨酰半胱氨酰甘氨酸

2．多肽抗菌素3．多肽激素4．神经肽 甲硫氨酸脑啡肽Tyr–Gly–Gly–phe-Met亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu功能：镇痛如脑啡肽(enkephalin)一、填空：1、在组成蛋白质的二十种氨基酸中，

是亚氨基酸，当它在a-螺旋行进中出现时，可使螺旋

。2、Lys的a-COOH、a-NH3＋的pK值分别为2.18和8.95，该氨基酸的pI值为9.74，则R基团的pK值为

，它是由

基团的解离引起的。3、Glu的pK1(a-COOH)=2.19、pK2(R基团)=4.25、pK3(a-NH3＋)=9.67，该氨基酸的pI值为

。二、选择题(注意：有些题不止一个正确答案)：1、下列什么氨基酸溶液不使偏振光发生旋转

(A)Ala(B)Gly(C)Leu(D)Ser(E)Val2、下列AA中，蛋白质内所没有的是

(A)高半胱氨酸(B)半胱氨酸

(C)鸟氨酸(D)胍氨酸3、在下列肽链主干原子排列中，哪个符合肽键的结构

(A)C－N－N－C(B)C－C－C－N(C)N－C－C－C

(D)C－C－N－C(E)C－O－C－N4、Cys的pK1(-COOH)为1.96，pK2(-NH3+)为8.18，pK3(R基团)为10.28，在pH为6.12的缓冲液中，该氨基酸所带电荷为正电荷(B)负电荷(C)无电荷(D)等电荷5、下列氨基酸中，在波长280nm处紫外吸收值最高的氨基酸是(A)Lys(B)Cys(C)Thr(D)Trp重要的化合物和化学反应：DNFB，Sanger反应PITC，Edman反应

第四节：蛋白质的分子结构一级结构初级结构（共价结构）二级结构高级结构（空间结构）三级结构四级结构在二级结构和三级结构之间还有另一些层次，如超二级结构和结构域。一.蛋白质的结构

蛋白质的一级结构（primarystructure）是指蛋白质肽链中氨基酸的排列顺序。而蛋白质的化学结构包括肽链数目、端基组成、氨基酸序列和二硫键的位置，又称共价结构。蛋白质的一级结构是最基本的结构，它决定着蛋白质高级结构。

以胰岛素为例，胰岛素是动物胰脏中胰岛β细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，它的主要功能是降低体内血糖含量。临床上用来治疗糖尿病。一.蛋白质的一级结构

最先由Sanger于1953年完成测定胰岛素一级结构.蛋白质的二级结构指多肽链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象。天然蛋白质包括α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲等二级结构。二.蛋白质的二级结构（一）二级结构的概念蛋白质分子的多肽链按一定方式折叠、盘绕或组装成特有的空间结构，亦称高级结构。蛋白质的高级结构即蛋白质的构象问题。

构型（configuration）是指不对称碳原子上相连的各原子或取代基团的空间排布（D-构型、L-构型）。构型的改变伴随着共价键的断裂和重新形成。构型和构象（一）二级结构的概念

构象（conformation）是指相同构型的化合物中，与碳原子相连的各原子或取代基团在单键旋转时形成的相对空间排布。构象的改变不需要共价键的断裂和重新形成。构型和构象

X-射线衍射技术研究表明，肽键C-N键介于单键和双键之间，具有部分双键性质，不能自由旋转，其中绝大多数都形成刚性的酰胺平面结构。蛋白质的构象虽是单键却有双键性质周边六个原子在同一平面上前后两个a-carbon在对角(trans)CNCHaNCOCa0.123nm0.133nm0.153nm0.145nmC--N0.145nm(正常)C=N0.133nmC=N0.125nm(正常)（二）酰胺平面Peptidebondplane

因此，从理论上讲，蛋白质中的所有Cα-C单键和Cα-N单键都能自由旋转而形成无数变化的构象。但事实上，一个天然蛋白质多态链在一定条件下只有一种或很少几种构象，而且相当稳定。

蛋白质的构象（二）酰胺平面1.这是因为主链上由1/3具有部分双键性质的C-N键，不能自由旋转。2.此外主链上由很多R侧链，其大小及电荷情况各异。3.它们在单链旋转时产生空间位阻和静电效应，制约着大量的构象形成。原因：1.

a-螺旋(a-helix)

2.

b-折叠(b-pleatedsheet)

3.

b-转角(b-turn)

4.

无规卷曲(nonregularcoil)（三）二级结构单元的种类1）肽链中的酰胺平面绕Cα相继旋转一定角度形成α-螺旋，并盘绕前进。每隔3.6个氨基酸残基，螺旋上升一圈；每圈间距0.54nm，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升0.15nm，旋转100°。α-螺旋结构的主要特点（P51）：1.α-螺旋(α-helix)2）螺旋体中所有氨基酸残基侧链都伸向外侧；肽链上所有的肽键都参与氢键的形成，链中的全部C=O和N-H几乎都平行于螺旋轴,氢键几乎平行于中心轴;

α-螺旋结构的主要特点：1.-螺旋(-helix)3）绝大多数天然蛋白质都是右手螺旋。每个氨基酸残基的N-H都与前面第四个残基C=O形成氢键。

α-螺旋结构的主要特点：1.-螺旋(-helix)

R为Gly时，由于Ca上有2个氢，使Ca-C、Ca-N的转动的自由度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大大降低。α-螺旋遇到Pro就会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚氨基酸。带相同电荷的氨基酸残基连续出现在肽链上时，螺旋的稳定性降低。侧链在a-螺旋结构中的作用：2、-折叠(-pleatedsheet)

β-折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结而成的锯齿状片状结构。

侧链基团与Cα间的键几乎垂直于折叠平面，R基团交替地分布于片层平面两侧。

β-折叠分平行式和反平行式，后者更为稳定。N端在同一端。氨基酸之间沿轴相距0.325nmN端不在同一端。氨基酸之间沿轴相距0.35nm2、-折叠(-pleatedsheet)

2、-折叠(-pleatedsheet)

维持β-折叠结构稳定性的力——

氢键由一条链上的羰基和另一条链上的氨基之间形成，即氢键是在链与链之间形成的。2、-折叠(

-pleatedsheet)

（a）平行式（b）反平行式2、-折叠(

-pleatedsheet)

3、-转角（

-turn）也称β-回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回折180°，使得氨基酸残基的C=O和与第四个残基的N-H形成氢键。β-转角都在蛋白质分子的表面。3、-转角（

-turn）4、无规则卷曲（non-regularcoil）

又称自由卷曲，是指没有一定规律的松散肽链结构。酶的功能部位常常处于这种构象区域。

无规卷曲常出现在a-螺旋与a-螺旋、a-螺旋与β-折叠、β-折叠与β-折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的。1.定义指蛋白质中相邻的二级结构单位(即单个-螺旋或-转角)组合在一起，形成有规则的在空间上能辩认的二级结构组合体。三.蛋白质的超二级结构2.类型-由两股或三股右手螺旋缭绕而成的左手螺旋-由两股折叠片，中间加入螺旋而形成的片层结构-由三条或更多的反平行式-链通过-转角或其它的肽段连接而成的结构2.类型A．；BX；C

；D-曲折；

E.回形拓扑结构

3.结构域(domain)指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体，称为结构域（domain）或功能域。酵母己糖激酶的三级结构两个结构域之间有一个裂隙3.结构域(domain)结构域之间有一段肽链相连—铰链区各个结构域可以相似或不相同结构域一般为酶活性中心结构域之间可以相对运动四.蛋白质的三级结构

三级结构指的是多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成球状分子结构。（一）三级结构的概念（二）球状蛋白的三级的结构特怔

具有三级结构的蛋白质分子含有多种二级结构单元。如具有三级结构的球状蛋白溶菌酶中含有螺旋、-折叠、-转角和无规卷曲四种二级结构卵溶菌酶（egglysozyme）的三级结构

（二）球状蛋白的三级的结构特怔大多数非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核；而极性侧链在分子表面，形成亲水面。分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋白质的活性中心

蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次。（三）维持三级结构的作用力二硫键

——

共价键

疏水作用非共价键（次级键）氢键离子键范德华力（三）肌红蛋白肌红蛋白由—条多肽链和一个血红素（heme）辅基构成，分子量为16700，含153个氨基酸残基。

抹香鲸肌红蛋白的三级结构

五.蛋白质的四级结构(一)四级结构的概念

四级结构：由两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚合而成、有特定三维结构的蛋白质构象。每条多肽链又称为亚基。血红蛋白由四条多肽链形成，是一种寡聚蛋白质。这四条链主要通过非共价键相互作用缔合在一起。血红蛋白分子上有四个氧的结合部位，因为每条链上含有一个血红素辅基。例如，血红蛋白的四级结构(一)四级结构的概念脱氧血红蛋白中不同亚基间的盐桥

(一)四级结构的概念(二)维持四级结构的作用力

疏水作用氢键离子键范德华力第五节：蛋白质的结构与功能（一）一级结构与功能的关系

以细胞色素C为例：细胞色素C广泛存在于真核生物细胞的线粒体中，是一种含有血红素辅基的单链蛋白质。在生物氧化时，细胞色素C在呼吸链的电子传递系统中起传递电子的作用，使血红素上铁原子的价数发生变化。1.同功能蛋白的种属特异性与一级结构的关系三、蛋白质结构与功能关系

脊椎动物的细胞色素C由l04个氨基酸残基组成，分子量约13,000左右；昆虫有108个氨基酸残基组成；植物则有112个氨基酸残基组成，大都沿N端延伸。对不同生物的细胞色素C的一级结构分析表明，大约有28个氨基酸残基是各种生物共有的，表明这些氨基酸残基是规定细胞色素C的生物功能所必需的。

其中包括第14和17位上两个半胱氨酸残基是细胞色素C与血红素辅基共价相连的位置；第70-80位上成串的不变氨基酸残基可能是细胞色素C与酶结合的部位。

在分子进化过程中，细胞色素C分子中保持氨基酸残基不变的区域称为保守部位。保守部位的氨基酸都是细胞色素C完成其生物学功能所必需的。

表4-5不同有机体中细胞色素C中的氨基酸顺序与人的差异生物名称

氨基酸差异数

生物名称

氨基酸差异数黑猩猩0鸡、火鸡13恒河猴1响尾蛇14兔9乌龟15袋鼠10金枪鱼21鲸10狗鱼23牛羊猪10蚕蛾31狗11小麦43骡11面包酵母45马12红色面包霉48

三、蛋白质结构与功能关系（一）一级结构与功能的关系

2.一级结构变异与分子病

所谓分子病是指由于遗传基因突变导致蛋白分子中某些氨基酸残基被更换所造成的一种遗传病。镰刀状细胞贫血病（sickle-cellanemia）是最早被认识的一种分子病，这种疾病在非洲的某些地区十分流行。病人的红细胞在氧气不足的情况下变形而呈镰刀状，故由此得名三、蛋白质结构与功能关系（一）一级结构与功能的关系

2.一级结构变异与分子病

通过对血红蛋白分子的一级结构研究表明，病人的血红蛋白（HbS）与正常人的血红蛋白（HbA）相比，在574个氨基酸残基中只有2个氨基酸残基的差异。HbA和HbS的-链是完全相同的，所不同只是-链上从N末端开始的第6位的氨基酸残基，在正常的HbA分子中是谷氨酸，而患者的HbS分子中为缬氨酸所代替，

2.一级结构变异与分子病

镰刀状细胞贫血病：Hb-A（正常人）：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHb-S（患者）：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-链12345678

2.一级结构变异与分子病

原因是什么？

Glu

和Val

分子的侧链在性质上有很大的不同。Glu

侧链带负电荷，而Val侧链是一个非极性基团，所以使得HbS分子表面的负电荷减少，这种变化使患者的血红蛋白容易发生聚集并形成杆状多聚体，这就是导致红细胞变形的原因。

在体内许多具有一定功能的蛋白质如酶蛋白、激素类蛋白等常以无活性的前体形式产生和贮存。在一定情况下，这些前体经特定蛋白酶水解，切除部分肽段后，才转变成有活性的蛋白质。这一过程叫做蛋白质前体的激活3.一级结构与蛋白质前体的激活例如：有功能的胰岛素含有51个氨基酸残基，由A、B两条链组成。但在胰岛细胞最初合成的是一个比胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称前胰岛素原，它是胰岛素原的前体，而胰岛素原是有活性的胰岛素的前体。前胰岛素原比胰岛素原在N末端上多一段肽链，称信号肽（signalpeptide），含有20个左右氨基酸残基，其中很多是疏水侧链残基。3.一级结构与蛋白质前体的激活（一）一级结构与功能的关系

许多蛋白质，如酶蛋白、激素蛋白等，它们在体内常以无活性的前体存在，在一定情况下经体内的蛋白酶水解，切去部分肽段后，才变成有活性的蛋白质。3.一级结构与蛋白质前体的激活前体胰岛素（84aa）

A链（21aa）

B链（30aa）C链（33aa）

活性胰岛素（二）空间结构与功能的关系

牛胰核糖核酸酶A（RNase）是由124个氨基酸残基组成的单链蛋白质，含有4个二硫键，并通过其它次级键使多肽链得以折叠成一个具有三维构象的、有催化能力的活性蛋白质。三维结构的形成对维持酶的活力是必不可少的。例一（二）空间结构与功能的关系

当天然的RNase在8molL-1尿素存在下用-巯基乙醇处理后，分子内四个二硫键即被断裂，整个肽链呈伸展的无规则的线形状态，同时酶活性完全丧失。但是当用透析方法将尿素和巯基乙醇除去后，RNase活性又可完全恢复。研究表明，复性后的产物与天然RNase并无差别。所有正确配对的4个二硫键都获得重建。（二）空间结构与功能的关系

（二）空间结构与功能的关系

血红蛋白的别构效应例二（二）空间结构与功能的关系

肌红蛋白与血红蛋白：两者三级结构相似别构效应。Po2/133Pa01.0

.0.5......20406080100活动肌肉中Po2肺泡中Po2氧饱和度肌红蛋白血红蛋白第六节：蛋白质的重要性质(一)胶体性质

蛋白质的分子量1万-100万之间，其分子直径1-100nm之间，在胶体颗粒的范围。蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成—层水膜。

所以蛋白质具有胶体性质，如布朗运动、光散射、电泳、不能透过半透膜及具有吸附能力等。利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方法称透析（dialysis）。

蛋白质能形成较为稳定的亲水胶体的另一个原因：蛋白质颗粒在非等电点状态时带有相同电荷，使得蛋白质颗粒之间相相互排斥，

(一)胶体性质(二)两性解离及等电点

蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，即能和酸作用，也能和碱作用。蛋白质分子中可解离的基团除肽链末端的-氨基和-羧基外，主要还是多肽链中氨基酸残基上的侧链基团如-氨基、-羧基、-羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的pH条件下，这些基团能解离为带电基团从而使蛋白质带电。

蛋白质的等电点（pI）：当某蛋白质在一定的pH的溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值叫做该蛋白质的等电点。蛋白质的带电性质与溶液的pH有关。利用蛋白质的两性解离可以通过电泳分离纯化蛋白质。(二)两性解离及等电点

蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫变性作用（denaturation）。1.蛋白质变性的概念2.蛋白质变性的因素物理因素：加热、紫外线、超声波、高压等；化学因素：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢剂、重金属盐等；(三)蛋白质的变性生物活性丧失（酶）；溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小（蛋清）；基团位置改变；对蛋白酶敏感性增大。3.蛋白质变性后的表现(三)蛋白质的变性4.蛋白的复性

蛋白质的变性作用若不过于剧烈，则是一种可逆过程。高级结构松散了的变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠形成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为复性(renaturation)。

大多蛋白质变性后，很难复性。(三)蛋白质的变性(四)蛋白质的沉淀加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，蛋白质的胶体溶液就不稳定,并将产生沉淀。能使蛋白质沉淀的试剂有：1.高浓度中性盐（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，用于蛋白质分离制备。2.有机溶剂丙酮、乙醇3.重金属盐Hg2+、Ag+、Pb+（与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐,或改变蛋白质的空间结构）4.生物碱试剂和某些酸类物质苦味酸、单宁酸

三氯乙酸、磺基水杨酸等（与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐）5.加热变性沉淀(四)蛋白质的沉淀(五)蛋白质的颜色反应1.双缩脲反应双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产物的颜色深浅在540nm处进行蛋白质的定量测定。

2.酚试剂（Folin-酚试剂）反应蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将Folin-酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常用来定量测定蛋白质含量。可根据反应产物的颜色深浅在540nm处进行蛋白质的定量测定.

(五)蛋白质的颜色反应3.茚三酮反应由于蛋白质多肽链两端有游离的-NH2和-COOH，所以蛋白质也可以和茚三酮发生反应。4.考马斯亮兰与蛋白质反应形成蓝色透明物质，在595nm下进行比色。(五)蛋白质的颜色反应(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定1.蛋白质分离、纯化的过程和一般原则（1）前处理（Pretreatment）细胞破碎，蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。（2）粗分级（Roughfractionation）当蛋白质混合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。（3）细分级（Finefractionation）是将样品进一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去。（4）结晶（Crystal）由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。2.蛋白质分离纯化的一般方法

（1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration）(六)蛋白质的的分离、纯化与鉴定b.密度梯度（区带）离心c.凝胶过滤（gelfiltration）葡聚糖凝胶过滤（2）根据蛋白质溶解度的差异进行分离的方法

等电点沉淀（iso