分子生物学课件

分子生物学概述OutlineofMolecularBiology主要内容：什么是分子生物学？分子生物学的发展历程分子生物学与医学发展2一.什么是分子生物学？围绕着生物的中心法则，重点在DNA水平上，通过研究生物大分子间相互作用及其互调网络，揭示生命及其规律的科学ProteinDNARNA3思维方式：传统生物学：从宏观到微观我国现在解剖学、组织胚胎学等发展始于20世纪初比欧美国家晚200多年从19世纪中期到20世纪初，关于细胞结构尤其是细胞核的研究，有了长足的进展1944年证明DNA是遗传物质1961-64年破译DNA遗传密码4思维方式：传统生物学：从宏观到微观分子生物学：从微观到宏观生物学5思维方式：传统生物学：从宏观到微观分子生物学：从微观到宏观基因异常生物体异常结构变化数量变化修饰变化？信号转导异常动态受精卵生长发育成熟6思维方式：传统生物学：从宏观到微观分子生物学：从微观到宏观最终目的：在分子水平上解释生物的生命本质DNARNA蛋白质分子生物学的中心法则7二.分子生物学的发展历程分子生物学的发展：源于对生命现象探究的渴望eagertoknow问题：你最想知道什么？8Whatislife?WhatIsLife?isa1944non-fictionsciencebookwrittenbyphysicistErwinSchrödinger.Schrödinger推测：含有遗传信息的物质是一种不断变换的液状晶体，由共价化学键维持其构型1950年，这种idea刺激了寻找遗传物质的热情1869年，已经知道DNA,但其功能及结构都未知9ChrickWatson分子生物学的诞生：起始于DNA双螺旋模板学说Watson：原从事鸟类研究的开始从事DNA相关研究是源于读了“Whatislife”这本小册子Crick：物理学家，一直思考两个问题：——分子为什么能使非生命体变成生命体？——头脑怎么就有智慧了呢？推测：DNA和蛋白质，DNA更可能是遗传物质Howmoleculesmakethetransitionfromthenon-livingtotheliving?Howthebrainmakesaconsciousmind?10知道了：DNA是遗传物质，DNA是双螺旋结构下面你最想知道什么？是不是想知道：—DNA真能决定生物体的一切吗？如果是，你这时最想干什么？—是不是想动一动DNA？11分子生物学的快速发展：起始对DNA的操作靶向化学键的操作：限制性核酸内切酶（RE）DNA连接酶DNA变性-复性切割磷酸二酯键形成磷酸二酯键氢键断裂-形成12问题：一旦实现了操作DNA了，你想干什么？好奇心可能驱使你将不同生物的DNA组装到一起看能出现什么奇迹，是吗？13问题：一旦实现了操作DNA了，你想干什么？好奇心可能驱使你将不同生物的DNA组装到一起看能出现什么奇迹，是吗？猿猴病毒DNA噬菌体DNA限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶重组DNA分子PaulBergabiochemistryatStanford1980年，获诺贝尔化学奖1972年：14真正意义上的DNA重组技术：1973年建立的基因克隆体系Plasmid1Plasmid2REREligaseRecombinantplasmidTransformationE.coli要点：不同来源DNA的重新组合在生物体内能自我复制无性繁殖StanleyCohen(Stanford)HerbertBoyer(UCSF)151974年，申请了重组DNA技术发明专利1976年,Boyer和投资人Swanson(29岁)作为发起人，创建了GenentechInc.第一个产品：重组人胰岛素(1982年上市)RobertA.Swanson

1947-1999

16—GenentechInc.的产品1982-Synthetic"human"insulin1987-Activase(alteplase)-todissolvebloodclotsinpatients.1990-Actimmune(IFN1b)-chronicgranulomatousdisease.1997-Rituxan(rituximab)-Treatmentforspecifickindsofnon-Hodgkinslymphomas.1998-Herceptin(trastuzumab)-Treatmentformetastaticbreastcancerpatients2000-TNKase(tenecteplase)-totreatacutemyocardialinfarction.2003-Xolair(omalizumab)-formoderatetoseverepersistentasthma.2004-Avastin(bevacizumab)-Anti-VEGFmAbforthetreatmentofmetastaticcancerofthecolonorrectum,locallyadvanced,recurrentormetastaticnon-smallcelllungcancer,untreatedadvancedHER2-negativebreastcancer.2004-Tarceva(erlotinib)-Treatmentforpatientswithlocallyadvancedormetastaticnon-smallcelllungcancer,andpancreaticcancer.2006-Lucentis(ranibizumab)-forthetreatmentofneovascular(wet)age-relatedmaculardegeneration(AMD).2010-Actemra(tocilizumab),IL-6R-inhibitingmAbtotreatrheumatoidarthritis.2012-Erivedge(vismodegib)-Treatmentforadvancedbasal-cellcarcinoma(BCC2012-PERJETAforuseincombinationwithHerceptin(trastuzumab)anddocetaxelchemotherapyforthetreatmentofpatientswithpreviouslyuntreatedHER2-positivemetastaticbreastcancer(mBC).17—关于GenentechInc.宗旨：UsinghumangeneticinformationTodiscover（发现）

develop（开发）

manufacture（生产）

commercialize（销售）

biotherapeuticsthataddresssignificantunmetmedicalneedsunmet:未满足的HerbertW.Boyer(UCSF)RobertA.Swanson

1947-1999

18接下来：不满足于只知道DNA构型1975年，DNA测序技术诞生WalterGilbertHarvardFrederickSangerUniversityofCambridge1980年获诺贝尔奖94岁1958年，第一次获诺贝尔化学奖Insulinproteinsequencing1980年，第二次获诺贝尔化学奖DNAsequencingTillnow，Sanger是第四个获两次诺贝尔奖的人发现一系列疾病相关基因1976年发现第一个病毒癌基因发现编码序列和非编码序列发现基因表达调控序列1990年启动人类基因组计划个体基因组测序

2007年：Watson,Venter

2008年：中国YH

Watson

Venter19—基因组测序1990年，人类基因组计划启动1996年，酵母(S.cervisiae)基因组测序1998年，线虫基因组测序2000年，果蝇基因组测序2001年，人类基因组草图完成2002年，小鼠基因组测序2003年，人类基因组计划结束2004年，发表人类基因组序列；大鼠基因组测序；鸡基因组测序2005年，狗基因组测序

猩猩基因组测序

第一个基因组范围相关性研究发表人类基因组与小鼠基因组高度同源（80%同源性）2005年开始，大规模小鼠基因敲除的研究计划在美国、欧盟和加拿大实施人类的研究工具10年4年2006年，第一个直接对消费者的基因组测序

海胆(seaurchin)基因组测序

蜜蜂基因组测序

基因型、表型-NCBIdatabase启动2007年，第一个个人基因组测序中国汉人基因组测序

人类遗传变异有重大突破的一年

猕猴基因组测序2008-11-6,第一个中国人YH的个人基因组序列发表在Nature上Yourlifeinyourhands—基因组测序212008年，遗传信息非歧视Act在美国通过第一个癌基因组测序(AML)

胶质瘤全基因组分析

鸭嘴兽(platypus)基因组测序

非洲优鲁巴人(Yoruba)基因组测序

第一个用新技术个人基因组测序2009年，韩国人基因组测序

第一张人类甲基化图谱2009年，牛基因组测序

国际数据释放研讨会

完成了哺乳动物基因收集(MGC)JamesWatson—基因组测序222010年，Exosome测序发现MillerFisher综合征的致病基因1000基因组试验性计划完成

穴居人(Neanderthal)基因组测序>1000小鼠基因敲除突变品系

第500个基因组范围的研究发表

南非人基因组测序附：MillerFisher综合征是一种罕见的多发性神经炎疾病，其病理现象即为脑干的脑神经核体功能缺损—基因组测序23—基因组中的“垃圾DNA”ENCODE(ENCyclopediaOfDNAElements)研究组上百位研究人员2012-9-6公布了最新成果:—人类基因组中“垃圾DNA”实际上是一个庞大的控制面板，能调控数以百万计基因的活性。Nature,489:57–74(06Sep2012).AnintegratedencyclopediaofDNAelementsinthehumangenome.Nature,489:101–108(06Sep2012).Landscapeoftranscriptioninhumancells.人基因组中，—1.5%编码蛋白，8.5%编码结合在DNA上的蛋白，调控基因转录—位于4%功能仍未知基因组中的一大片与其他哺乳动物不同，预示受到了进化的“约束”24接下来：不满足于只知道DNA构型不断发明新技术以满足新需求GH转基因小鼠1981年，大鼠生长激素(GH)基因被转入小鼠体内（转基因技术）转基因动物基因敲除动物转基因-基因敲除动物克隆动物用于生物制品的生产如：人凝血因子Ⅷ(羊奶中)作为模式生物如：Dolly早衰模型25分子生物学的使命：试图从根本上解释生命的奥秘学科特点：中心法则作为理论体系核心操作基因作为技术体系核心提出理论产生技术上的需求发明技术提出新的理论分子生物学在这样的循环中得到发展DNA是遗传物质DNA结构及功能关系操作DNA改变生物遗传物质制造模式生物揭示人类自身生老病死的机制26DNA重组技术重组蛋白人源抗体重组多肽药物重组疫苗基因克隆DNA序列测定重组载体基因治疗载体RNA转录载体打靶载体转基因载体基因敲除动物模型转基因动物模型发夹RNARNAi核酸探针标记分子杂交SouthernblotNorthernblot构建文库基因组文库cDNA文库基因合成PCR-克隆-亚克隆基因突变基因敲除动物模型RNAi以DNA重组技术为核心技术：27一些成果？从根本上研究人类的起源、进化等奥秘问题人类的近亲——猩猩98%相似性1.44%差异2005,Nature比较基因组学表观遗传学人与人之间有多大差异？人与其他生物间有多大差异？北京猿人是不是中国人的祖先？DNA序列不变但基因功能可遗传性变化环境因素与生物进化？28一些成果？从根本上研究人类的起源、进化等奥秘问题寻求造福于人类的新途径生物制药公司改良动植物品种用生物体作为制药工厂大肠杆菌：干扰素，胰岛素酵母：HBsAg,HPV疫苗昆虫细胞：HPV疫苗大动物：凝血因子Ⅷ抗病虫害的植物抗病毒感染的家畜转基因大豆转基因家禽转基因猪问：转基因动植物对人体到底有没有害？29医学分子生物学在分子水平上，探讨人类生、老、病、死的分子机理挖掘分子水平干预疾病的线索和方法利用分子生物学的理论和技术使不可能成为可能如果人类各种器件都能自我更新，人还衰老吗？用皮肤细胞培育出心脏，你信吗？2008年，小鼠皮肤细胞心肌细胞、血管平滑肌细胞、造血细胞2008年(NatMed)，利用大鼠心脏脱细胞支架的第一个人工心脏诞生30OneoftheTaylorteam’sbio-artificialheartsinajar生物反应器将大鼠心脏的细胞去掉，保留心脏的三维结构Ittookaboutayear31ScientistscreateartificialjellyfishfromratheartcellsUsingratheartmusclecellsandathinsiliconefilm,researchershaveconstructedaswimmingjellyfishlikecreature.水母ByStephaniePappas,

LiveScience/July23,2012agoodmodeltousetostudycardiacphysiology你也许会问：这与分子生物学有什么关系？32三.分子生物学与医学发展传统医学，比如中医学现代医学，比如西医学望、闻、问、切个性化诊疗模糊处理内在与外在的关系系统性分析避免个性偏差从解剖开始精确到器官、细胞，必然寻求更精确的解释结合？33分子变异与疾病1956年，发现镰状细胞性贫血的主要原因是珠蛋白的第6位谷氨酸变为缬氨酸镰状细胞性贫血后来证明：疾病的本质是编码珠蛋白的基因发生了点突变GAG(谷氨酸)GTG(缬氨酸)点突变这是第一次确认的一种疾病由一个分子的一个特定改变所引起34—老年痴呆阿尔海默氏痴呆症血管性痴呆症其他类型的痴呆症美国前总统——里根中国和欧美国家发病率相似>65岁：2-5%发病>85岁：50%以上发病早期发病(<65岁)：<1%病例与APP、PS1和PS2基因突变有关。晚期发病(>65岁):载脂蛋白酶E4(APOE4)基因的过度复制可能是重要原因1994年里根被诊断为Alzheimerdisease1994.9.21被确定为worldAlzheimer’sday2011年：通过鼻腔将胰岛素送入脑内，近70%患者在4个月内记忆力有所改善2012年：抗癫痫药左乙拉西坦在小鼠模型中能降低50%脑内异常网络活动并改善记忆351970年，从鸡肉瘤中分离到能使细胞转化成肉瘤的病毒HaroldVarmus

J.MichaelBishop1976年，发现病毒癌基因Src(1989年获Nobel奖)

之后确定了细胞癌基因的概念因此，对肿瘤发生发展机制方面的知识影响巨大现在已经发现大约40个不同的癌基因这种发现也拓宽了人们洞察复杂信号系统的视野，从而掌控细胞的正常生长—恶性肿瘤36 Prostate LungandbronchusColonandrectum Uterinebladder Melanomaofskin Non-HodgkinlymphomaKidney&renalpelvis Leukemia OralCavity Pancreas AllOtherSites 33%12%10% 7% 5% 4%3% 3% 3% 2% 17% 28%15%9% 7% 5% 4% 4%

4%

3%

Men:710,0402005and2011EstimatedUSCancerNewCases789,6202005201137Women:662,870 Breast LungandbronchusColonandrectum Uterinecorpus Non-Hodgkinlymphoma MelanomaofskinOvary Thyroid Urinarybladder Pancreas AllOtherSites 32%12%11% 6% 4% 4%3% 3% 2% 2% 21% 28%14%10% 6% 4% 4% 3% 5%

3%

2005and2011EstimatedUSCancerNewCases

739,9402005201138疾病的分子诊断从基因水平上判断癌症的预后提供治疗方案选择的依据,如Her2MammaPrint:Agendia’s开发美国FDA批准同时检测70个基因判断乳腺癌转归据分析：80%乳腺癌术后没有必要进行化疗提问：我们现在为什么对几乎所有癌症术后患者进行化疗？敢不敢不化疗？391990年，世界上第一例真正意义上的基因治疗将腺苷脱氨酶(ADA)基因用逆转录病毒作载体导入ADA缺陷病人的T淋巴细胞中基因治疗对象：4岁女孩ADA缺乏性严重复合型免疫缺陷病替代疗法虽然从此掀起基因治疗研究的热潮基因治疗仍面临极大的困难和挑战疾病的分子治疗40—基因型与治疗HBV感染：全世界有3亿多携带者，我国有1.2亿人长期携带我国每年死于HBV相关肝病人数28万HCV感染：全球有1.7亿人感染丙肝全球每年约30万例死于丙肝引起的肝癌中国约3800万丙型肝炎重症感染者33%HIV感染者合并HCV感染研究发现：人基因组上与IL-28基因相连的一个基因的一个点突变，显著影响丙肝的治疗效果<Nature>(2009-8-16)TC突变30%治愈80%治愈干扰素+利巴韦林41疾病治疗的生物替代品重组蛋白(多肽)产品：IFN,IL-2,GM-CSF…基因治疗载体：病毒，质粒…转基因细胞干细胞：胚胎干细胞，诱导型多能干细胞inducedpluripotentstem(iPS)embryonicstemcell(ES

cell)将皮肤等体细胞诱导成多能干细胞问题：为什么能将终末分化的细胞变成干细胞呢？42掌控细胞的命运缘于对基因表达调控的认识基因组重新编程(re-programme)在受精过程中精子提供另一套染色体精子还提供6种mRNA这些mRNA：使基因组重新程序化？是生命之初的基因开关？43iPS细胞的启示：基因组重新程序化并不需要太复杂的因素四种转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)可将体细胞转化为iPS细胞单个转录因子Oct4可将人神经干细胞诱导成iPS细胞细胞这么容易就能获得全能性，你能想象一下细胞癌变的难易吗？器官移植的材料来源还是问题吗？44Early-stageepigeneticmodificationduringsomaticcellreprogrammingbyParp1andTet2.Nature,488:652–655(30Aug2012)2012年8月：基因表达受到两类蛋白的共同控制：—转录因子—表观遗传调控子以各种方式来影响基因的表达，如通过改变组蛋白直接结合到DNA上发挥作用两种表观遗传调控因子Parp1和Tet2—刺激了成纤维细胞中静止多能基因的表达，由此启动了这些细胞重编程为iPSCs—成纤维细胞中Oct4诱导了Parp1表达Oct4转录因子Parp1表观调控因子启动多能基因的表达问题：表观调控因子是如何“知道”哪些基因需要被重新激活？是否广泛除去对整个基因组基因表达的抑制？是通过重编程转录因子引导到特异的基因？45哪种疾病与基因没关系呢？每个人在这个世界上都是独一无二的每个基因组序列都不可能是一样的(同卵双生？)你能回答下面的问题吗？同一环境下为什么有人感冒了而你安然无恙？同样的饮食营养为什么有人得动脉硬化了？同样的打击为什么有人疯了？那是因为，他们的基因有差异，序列不一样？修饰不一样？数目不一样？位置不一样？其实，就是老百姓说的“体质”不一样46—不同个体的基因组有差异中国人YH基因组序列与Watson和Venter序列的异同AllSNPsnon-synonymousSNPsgeneswithnon-synonymousSNPssynonymous同义的47未来医学研究的思维方式：单基因病几个基因病复杂性状疾病的遗传背景研究肿瘤心血管系统疾病糖尿病重要感染性疾病疾病易感性药物敏感性个体基因组与环境相互作用基因突变基因多态性表观遗传改变环境相互作用遗传背景参与分子易感因素疾病的诊断：评价疾病的存在状态预测疾病的转归及预后评判疾病在个体发生的风险性48—从碱基到病床基因组结构基因组生物学疾病生物学前瞻医学科学改善医疗保健1990-2003人类基因组计划2004-20102011-20202020以后—Nature,Feb10,201149—60年前我们无法想象通过操作遗传物质来认识生命的奥秘—今天我们也无法想象未来生命科学会出现怎样的巨变但我们知道：—分子生物学能带领我们去探索生命的奥秘50小结：主要内容：分子生物学的概念——中心法则，DNA分子生物学的发展历程—DNA双螺旋模板学说——分子生物学诞生—分子生物学快速发展——DNA操作，基因克隆分子生物学与医学发展—疾病与基因变异、异常开启或关闭有关—分子诊断与治疗方案选择有关51这门课需要准备的知识：普通生物化学遗传学简单病毒学和细菌学细胞生物学52自学内容：三种生物大分子的基本特性关键酶的功能基因表达原核细胞和真核细胞DNA结构、DNA复制、DNA重组DNA序列，基因组及其序列元件(element)DNA聚合酶，RNA聚合酶53Abriefreview：DNA结构特性：一级结构：

GATC四种核苷酸——3-5磷酸二酯键——5-P，3-OHOHCH25'H4'3'2'1'OPOOO5'O3-H，？ATGCCGTAGCATATCGGCCGTATATAATCG5'3'3'5'3.4nmMinorgrooveMajorgrooveSugar-phosphatebackboneBasepair二级结构：方向相反的双链螺旋——氢键(力)双链间可插入化合物(如溴酚蓝EB)变性复性碱基序列磷酸二酯键互补配对—对象是谁？—方式？(碰撞)54NativeDenaturedFastSlowRelativeabsorbanceTmCoolTemperature0.51.01.5你能知道DNA是否发生变-复性了吗？在紫外分光光度计A260处检测光密度值(OD)dsDNA:OD1.0ssDNA:OD>1.0改变温度：快降温:局部退火慢降温：完全配对55双螺旋类型有什么意义吗？DNA右手螺旋（B-DNA）Watson-Crick右手双螺旋结构

静态结构稳态结构正常结构生物体内的DNA几乎都是以B-DNA形式存在的DNA左手螺旋（Z-DNA）

暂态结构活性结构56DNA高级结构：超螺旋结构在细胞内组装成致密结构——染色体染色体末端有端粒结构染色体的最基本单位是核小体

nucleosomePositivenegative串珠样结构中每个核小体重复单位的DNA长约200bpDNA可以从核小体结构中释放出来(动态的)DNA组蛋白：核心组蛋白H1蛋白telomere57DNA序列：编码序列(2-3%):基因外显子exon非编码序列(>95%)：内含子intron基因的非编码序列(侧翼序列)调节序列启动子promoter增强子enhancer操纵子(原核)operon基因组中的序列元件：基因序列调节序列重复序列(串联重复如卫星DNA，反向重复)其他序列(假基因，CpG岛)与免疫关系？转座子？亲子鉴定？58编码序列中含有开放阅读框架：Openreadingframe,ORF密码子(codon)问题：密码子在什么时候发挥作用？谁来识别密码子？你能理解稀有密码子或偏爱密码子概念的实质吗？你怎么理解基因表达与非编码序列也有关？mRNADNA59基因表达调控Geneexpression®ulation61几个相关概念62一段特定的DNA序列生物体的基本遗传单位

(Ageneisamolecularunitofheredityofalivingorganism)GeneisanamegiventosomestretchesofDNAandRNAthatcodeforapolypeptideorforanRNAchainthathasafunctionintheorganism.1.基因(Gene)632.基因表达(Geneexpression)First,theDNAonwhichthegeneresidesmustbetranscribedfromDNAtomessengerRNA(mRNA).Second,itmustbetranslatedfrommRNAtoprotein.将贮存在基因中的遗传信息变成具有生物学活性蛋白质或RNA的过程Inallorganisms,therearetwomajorstepsseparatingaprotein-codinggenefromitsprotein:Thegeneticcodeisthesetofchemicalsymbolsbywhichageneistranslatedintoafunctionalprotein.643.基因表达调控(Regulationofgeneexpression)在外环境作用下，细胞内的特定因素控制特定基因表达的规律及其机制Includestheprocessesthatcellsusetoregulatethewaythattheinformationingenesisturnedintogeneproducts.主要内容：转录水平的基因表达调控翻译水平的基因表达调控染色体水平的基因表达调控6566转录水平的基因表达调控对DNA的调控671.基因转录需要具备哪些条件？基因是一段特定的DNA序列基因表达：Gene(DNA）mRNAProteinATGATGATCGATCTATCGATCGATTAGAGGTAA转录mRNA—依照DNA序列合成mRNA的过程RNA聚合酶：负责合成RNA

需要识别及/或特定DNA序列—启动转录

—终止转录基因序列：应该位于启动位点与终止位点之间68我们再将基因完善如下：ATGACGATCGATCTATCGATCGATTAGAGGTAA转录mRNA—依照DNA序列合成mRNA的过程可见，—RNA聚合酶并不需要直接与基因的编码序列结合—具备startpoint和terminator的DNA序列就可以被转录

称这种序列为转录单位(transcriptionunit）StartpointTerminator启动子PromoterAUG5-non-codingsequence3-non-codingsequence—具备完整转录单位的基因才能被转录69原核基因以操纵子为转录单位transcriptionStartpointtermination调控区信息区启动子操作子串联的结构基因—多顺反子顺式作用元件一个操纵子是一个转录单位转录调控也是以操纵子为单位的70可见，基因转录需要具备：完整的转录单位（启动子-基因-终止子）RNA聚合酶712.启动子可影响基因的转录启动子可直接影响RNA聚合酶对转录的起始ATGACGATCGATCTATCGATCGATTAGAGGTAAStartpointTerminator启动子Promoter-35区：T82G78A65C54A95-10区：T80A95T45A60A50T96Consensussequence(共有序列)+1转录方向-GTGTATTGACATGATAGAAGCACTCTACTATATTCTCAATAGGTCCACG--CACATAACTGTACTATCTTCGTGAGATGATATAAGAGTTATCCAGGTGC-+1-10-355'5'3'3'大肠杆菌的启动子：72大肠杆菌启动子有3个功能区：—起始部位(initiationsite)：+1区—结合部位(bindingsite)：-10区—识别部位(recognitionsite)：-35区-GTGTATTGACATGATAGAAGCACTCTACTATATTCTCAATAGGTCCACG--CACATAACTGTACTATCTTCGTGAGATGATATAAGAGTTATCCAGGTGC-+1-10-355'5'3'3'如果启动子序列有变异，RNA聚合酶结合能力会发生变化—促进RNA聚合酶的结合能力（强启动子）—减弱RNA聚合酶的结合能力（弱启动子）真核基因的Ⅱ类启动子：TATAboxCAATboxGCbox

增强子

核心元件

结构基因-GCGCCAATTATAInitiator,Inr起始子-3+5上游元件远端调控区TATAAAA5-Y-Y-A+1-N-T/A-Y-Y-Y-3Y：C或TN：任意碱基T/A：T或A与位置、方向无关，一个基因可受多个增强子调控+1Startpoint启动子：—位于基因的上游—启动其下游基因的转录—决定转录方向机模板链74附：启动子变异也会引起疾病例如，-地中海贫血患者在-珠蛋白基因与其远端上游调控元件之间有一个SNP(AG)TAATAATGATAA转录因子GATA-1结合位点GATA-1GATA-1两个结合位点竞争结合GATA-1转录因子TGATAATGATAA珠蛋白编码基因从而干扰原有启动子的活性，下调珠蛋白的表达水平75可见，启动子的序列和位置对转录有影响启动子的序列可影响RNA聚合酶的结合能力763.RNA聚合酶(RNApol.)的转录活性原核生物只有一种RNA聚合酶RNApol.全酶问：如果编码RNA聚合酶的基因突变了会怎样？77大肠杆菌的RNA

pol.全酶覆盖-40~+20区域RNA聚合酶移动方向：35—RNA聚合酶是抗菌靶点例如：利福平—亚基肝素——亚基(体外)问：具备RNApol.和启动子，基因一定能被转录吗？784.调控蛋白参与基因转录的调节-35-10+1+20+28RNA聚合酶结合区阻遏蛋白结合区原核基因的操纵子：RNA聚合酶和阻遏蛋白结合区有部分是重叠的即：一旦阻遏蛋白先结合了，RNA聚合酶就无法转录

反之亦然79例：乳糖操纵子调控模式乳糖操纵子(Lacoperon)：阻遏蛋白负调控CAP正调控Catabolitegeneactivatorprotein,CAP(分解代谢物基因活化蛋白)IPOLacZLacYLacAStructuregenesRepressorgeneRepressorbindingsiteRNApol.bindingsiteCAPbindingsite乳糖操纵子结构：80IPOLacZLacYLacAStructuregenesRepressorgeneCAP-bindingsitetranscriptionmRNANoexpression阻遏蛋白的结合阻碍RNApol的通过：81IPOLacZLacYLacAStructuregenesRepressorgeneCAP-bindingsiteExpressionX诱导物可解除阻遏蛋白的阻遏：82真核生物有三种RNA聚合酶—转录调控主要是对RNApolII活性的调控—RNApolⅡ不能直接与DNA结合转录因子复合物：为RNApolⅡ搭起了接近并结合DNA的“脚手架”也是决定基因是否启动转录以及转录强度的关键因素TBPRNAPolymeraseII+10+20Startpoint-10-20-30-40+1ATGRNAPolymeraseIIRNAPolymeraseII基因转录83小结：基因是一段DNA序列基因转录需要完整的转录单位转录单位：“启动子-基因-终止子”结构框架启动子是RNA聚合酶识别及/或结合位点RNA聚合酶活性直接影响基因转录调控蛋白参与调控RNA聚合酶的转录活性总之，蛋白质-DNA的相互作用都是在影响RNA聚合酶的转录活性84翻译水平的基因表达调控对mRNA的调控851.核糖体定位到mRNA上启动翻译原核生物mRNA上的SD序列决定翻译起始效率核糖体(ribosome)：是蛋白质-rRNA复合物通过rRNA与mRNA互补配对方式结合到mRNA上SD序列(Shine-Dalgarnosequence)基本特点：一般位于mRNA上游距AUG约8-11nt位点由6个核苷酸组成的consensussequenceInE.coli,AGGAGG基本功能：负责招募核糖体定位到起始密码处，启动蛋白质的合成互补序列：CCUCCU，位于16SrRNA的3-end被称作anti-SDsequence在多顺反子mRNA中，每一个蛋白编码区都有一个AUG，在AUG上游都有一个SD序列AUGAUGAUGAUGSDSDSDSD核糖体可直接结合到mRNA上的任何一个SD序列上，并从其后的AUG开始启动蛋白质的翻译SD序列与AUG之间的距离直接影响基因产物的翻译效率XXXXXXXAUG7basesSDpromoterIL-2geneStartpointTranscriptionTranslationIL-2表达最高XXXXXXXXAUG8basesSDpromoterIL-2geneStartpointTranscriptionTranslationIL-2表达水平降低500倍因此，SD序列的位置在基因表达调控中起重要作用例如：89问题：SD序列与AUG之间的距离直接影响基因产物翻译效率的本质是什么？其实：是影响了核糖体精确定位到AUG上90Kozak序列(Kozaksequence)真核生物mRNA上有Kozak序列Kozak序列是真核mRNA上的一段序列Consensussequence：(gcc)gccRccAUGG一般是嘌呤(A或G)-6-5-4-3-2-1+1+2+3+4核糖体启动翻译需要识别Kozak序列但Kozak序列并不是核糖体结合位点(RBS)5’-capofmRNALocatedat91附：Kozak序列变异可引起疾病在意大利东南部的一个家庭：-球蛋白(+)mRNA的-6GC地中海贫血形成血红蛋白的球蛋白比例错误：-链-链相对过剩不能形成四聚体-链与红细胞膜结合并产生毒性这是第一例Kozak序列突变引起的疾病AUG作为翻译起始密码子是Kozak序列中重要的核苷酸+4G和-6G对于翻译起始非常重要-1、-2位核苷酸并不保守，但对于Kozak序列的强度还是有作用92可见，核糖体的精确定位是翻译的重要步骤原核SD序列、真核Kozak序列与核糖体定位有关932.mRNA本身也是翻译调控的靶点原核生物的mRNA转录、翻译、降解偶联进行RNApol大多数细菌mRNA都非常不稳定—细菌mRNA的平均半衰期2min细菌的转录和翻译有相似的速率在37℃条件下：mRNA转录：40nt/s≈13aa蛋白质翻译：15aa/s≈45nt94真核mRNA需要经过剪接后运输到胞浆—mRNA的运输是受控制的细胞核细胞浆mRNAcaptail进入细胞浆的mRNA才有机会作为蛋白质合成的模板留在核内的RNA大约在1小时内降解成小片段—大约只有20%的成熟mRNA有机会被运输到细胞浆中95真核mRNA的剪接是有选择性的—剪接是一个基因产生多种mRNA的原因5...AAGUAAGU…..CURAY..(10-40)..(U/C)11NCAGG…3IntronExonExon5-splicesite3-splicesiteBranchpointsequencePolypyrimidinetractConsensussequencesofsplicingsites:问：如果剪接位点变了会怎样？动画：mRNAsplicing96FGFR1Kinase-deficientFGFR1In1994-1996,—myworkinUCSFDNAcloningDNAsequencingGenefunctionassay—tyrosinekinaseactivityRNaseprotectionassay例：FGFR1mRNA选择性剪接产生一种激酶活性缺失型FGFR1WangLiying,etal.Anaturalkinase-deficientvariantofFGFR1.Biochemistry，1996,35(33):10134Lost111bp(for37aa)lengthofanexon97真核mRNA可被特异性阻抑或降解—siRNA诱导转录后沉默SmallinterfereRNA(siRNA)Lin-4miRNAtargets3-UTRofLin-14mRNA:3UTRLin-14mRNALin-4miRNALin-14蛋白质siRNA是一种小双链RNA，可以通过激活Dicer发挥定向切割靶RNA作用这种现象也叫转译抑制

(translationalinhibition)Lin-4miRNA是人们鉴定出的第一个microRNA分子Lin-4miRNA以不完全互补方式靶向Lin-14mRNA参与调控线虫的发育时序Lee,R.C.;Feinbaum,R.L.;Ambros,V.(1993)."TheC.Elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14".Cell

75(5):843–85498为什么一个只有21nt的RNA分子起着如此重要的调节作用？—个别现象？2000年发现第二个miRNA—miRNAlet-7控制线虫的发育时序人和果蝇有同源物参与多种癌症的发生ReinhartB.J.etal.(2000)."The21-nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans".Nature

403(6772):901–906.PasquinelliA.E.etal.(2000)."Conservationofthesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA".Nature

408(6808):86–89.—miRNA的发现也是对中心法则中RNA次要的中介角色的重要补充99问：你怎么理解mRNA末端有非翻译区？Un-translatedregion(UTR)ATGTGAInitiationorstartpointTermination+1CodingsequenceStartcodonStopcodon5-UTR3-UTRAnexonisanucleicacidsequencethatisrepresentedinthematureformofanRNAmolecule100真核mRNA的帽尾结构参与蛋白翻译—3-poly(A)尾缩短使mRNA易降解mRNA上的“AAUAAA”是加尾信号加尾信号后30bp处加上polyA尾(200-300nt)问：在一个基因的DNA序列中是否含有polyA尾的模板序列？动画：lifecycleofanmRNA101小结：核糖体与mRNA的结合是调控要点之一原核mRNA的SD序列和真核mRNA的Kozak序列都是与核糖体启动翻译有关mRNA自身的稳定性及定位也影响蛋白翻译miRNA直接在mRNA水平阻抑蛋白翻译总之，真核细胞有核，mRNA水平的调控环节更多比原核细胞多包括：选择性运输，选择性剪接，帽尾结构、miRNA阻抑，等ProteinDNARNA102染色体水平的基因表达调控转录前的染色体变构103真核染色体：DNA缠绕在组蛋白上形成染色体真核染色体多且结构致密人：23对染色体

也就是说：染色体是否适当的松解变构对直接影响基因表达问：你知道原核生物的染色体结构吗？Protein-membranecoreorscaffoldSupercoileddomain50-100kbindependentloopsordomains负超螺旋DNA以蛋白质-细胞膜为支架104转录前的调控主要是对染色质变构的调节其实，—就是有效暴露待转录的DNA序列影响因素：组蛋白与DNA的亲和性DNA甲基化程度目的：—增加转录因子和RNApol对DNA的易接近性组蛋白乙酰化：“loosen”核小体(ribosome)使核心组蛋白从DNA上移位暴露一些供其他蛋白结合的位点105问：一旦组蛋白发生变异可能会出现什么事件？那么，当H5替代H1组装核小体如何？已知：H1从核小体上的解离是释放DNA的重要因素与DNA的亲和性：H5>H11062012年8月(Nature)：基因表达受到两类蛋白的共同控制：—转录因子—表观遗传调控子DNA甲基化及组蛋白乙酰化都属于表观调控的结果DNA甲基化能引起：—染色质结构改变—DNA构象改变—DNA稳定性改变—DNA与蛋白质相互作用方式的改变——Early-stageepigeneticmodificationduringsomaticcellreprogrammingbyParp1andTet2.Nature,488:652–655(30Aug2012)调控基因表达107通过基因组重编程诱导出多能干细胞（iPS）两位科学家刚刚因此获2012年诺贝尔奖ShinyaYamanakaBorn:1962Affiliationatthetimeoftheaward:KyotoUniversity,Kyoto,Japan,GladstoneInstitute,SanFrancisco,CA,USASirJohnB.GurdonBorn:1933Affiliationatthetimeoftheaward:GurdonInstitute,Cambridge,UnitedKingdomTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2012Forthediscoverythatmaturecellscanbereprogrammedtobecomepluripotent108Heasked:arethecellsofanadultorganismgeneticallyidenticaltothefertilizedeggfromwhichtheyarederived?Hehypothesisedthatitsgenomemightstillcontainalltheinformationneededtodriveitsdevelopmentintoallthedifferentcelltypesofanorganism.体细胞核去核卵细胞In1962,hetestedthishypothesis.Thenucleusofthematurecellhadnotlostitscapacitytodrivedevelopmenttoafullyfunctionalorganism.109In2006,heandhisteamgeneratedinducedpluripotentstemcells(iPScells)fromadultmousefibroblasts.Theystartedwith24transcriptionfactorsknowntobeimportantintheearlyembryo,butcouldintheendreduceitto4transcriptionfactors-Sox2,Oct4,Klf4andc-Myc.Takahashi,K.;Yamanaka,S.(2006)."InductionofPluripotentStemCellsfromMouseEmbryonicandAdultFibroblastCulturesbyDefinedFactors".Cell

126(4):663.Tomoda,K.;Yamanaka,S.(2007)."InductionofPluripotentStemCellsfromAdultHumanFibroblastsbyDefinedFactors".Cell

131(5):861–872.110目前的研究方向主要有两个：1.建立符合临床应用标准的人的iPS细胞库2.研究iPS细胞产生的分子机制研究背景：1962年，JohnGurdon通过核移植实验证明体细胞核具有发育成个体的潜能，提示可以将体细胞核重编程为多能性细胞1987年，Davis等人报道通过过表达MyoD，可以将成纤维细胞转分化为肌细胞，特定转录因子可将体细胞重编程为多能干细胞111问题：表观调控因子是如何“知道”哪些基因需要被重新激活？是否广泛除去对整个基因组基因表达的抑制？是通过重编程转录因子引导到特异基因上去的吗？迄今为止，还不清楚iPS细胞在重编程过程中到底发生了什么是表观调控因子对基因组进行重新程序化的吗？112小结：转录前水平的调控主要涉及：1.染色质变构（组蛋白修饰，…）2.DNA修饰（DNA甲基化，…）基因组重编程——iPS细胞表观调控子在转录前调控中的重要作用基因分析的基本技术1

CentralDogmaProteinDNARNATranslationTranscription脱氧核糖核酸Deoxyribonucleicacid

碱基Base脱氧核糖核苷酸Deoxyribonucleotide：腺嘌呤（Adenine,A）胸腺嘧啶（Thymine,T）鸟嘌呤（Guannine,G）胞嘧啶（Cytosine,C）磷酸PhosphateOP-OO-OCH25'OOHH4'3'2'1'戊糖Pentose

H2OOHCH25'OH4'3'2'1'OPOOO5'OPOOO5'CH25'OH4'3'2'1'OPOOOCH25'OH4'3'2'1'OH3’,5’-Phosphodiesterbond脱氧核糖核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来，形成多核苷酸长链HOPOOOOPOOOOPOOOCH25'OH4'3'2'1'OH

ATGCDoubleHelixModelBasepairing：Sugar-phosphatebackbone脱氧核糖和磷酸交替连接排在外侧，构成基本骨架。碱基排在内侧，根据碱基互补配对原则通过氢键相结合，形成碱基对。FrancisCrickJmesWatson26-yr35-yrDNA分子由两条相互平行的脱氧核糖核苷酸长链盘绕而成NobelPrizeinPhysiologyorMedicine一.核酸印迹技术与分子杂交二.DNA芯片技术三.几种特殊的PCR技术Outline

一、核酸印迹技术与分子杂交NucleicAcidBlottingandMolecularHybridizationSouthern印迹（SouthernBlot）

Northern印迹（NorthernBlot）点杂交（DotBlot）原位分子杂交（insituhybridization）什么是核酸分子杂交（molecularhybridization）

以DNA的变性与复性为理论基础指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程。HighpHLowsaltHightemperature

氢键断裂是DNA的变性过程DNA变性：氢键断裂两条单链分开磷酸二酯键不受影响碱基排列顺序不变

互补单链重新形成氢键是DNA的复性过程lowpHhighsaltlowtemperatureDNA的复性：单链DNA在溶液中随机碰撞互补单链通过碱基配对形成氢键两条重新缠绕在一起的互补链不一定是原来的两条链

核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程。

用带有标记的、已知序列的核酸片段

(单链RNA或DNA)作为探针，与待测DNA或RNA样品进行核酸分子杂交，来检测被测样品中是否有与探针序列同源的目标序列，以及目标序列的量的一种方法。

核酸探针基因组DNA

探针：外显子区cDNA

探针：特异性高RNA探针：特异性高，本底低寡核苷酸探针：人工合成，检测突变类型：标记物：同位素:非同位素:32P，35S，3H

生物素、地高辛、荧光素DetectHybridsdenatureHybridizeAdddenaturedprobeDNA(labeled,complementarytothedesiredtemplate),Mix2.加入变性的探针DNA1.变性3.杂交4.检测杂交体

1.SouthernBlot1975年，英国人EdwinMellorSouthern创建①制备待测DNA样品、标记基因探针；②电泳分离待测DNA样品；③待测DNA样品的变性、转膜；④杂交；⑤显色。将电泳分离的待测基因组DNA酶切片段转移到一定的固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交的过程，基本流程如下：

①.将内切酶消化的DNA片段进行电泳分离DNAIsolation

REDigestion

Agarosegelelectrophoresis②.

胶中的DNA经变性及中和后,转膜Neutralize

Blot：TransferDNAontoNCmembraneDNAisdenaturedbyNaOHSouthernBlot基本操作过程

转膜方法（1）（Note：Allthelayersarepressedtightlytogether）dry毛细管虹吸法Southern转膜示意图

转膜方法（2）电转法转膜装置示意图

标记的探针杂交袋将硝酸纤维素膜放入杂交袋中：预杂交:Pre-hybridization(Blocking)

杂交：与标记的核酸探针共孵育(Hybridization)

洗膜：removeextraprobesboundtoNCmembrane放射自显影后的X光底片将硝酸纤维素膜与X