微生物的分离和纯培养课件

第二章微生物的纯培养和显微技术微生物的分离和纯培养显微镜和显微技术§1微生物的分离和纯培养微生物纯种分离将多种混杂微生物，经某种技术或方法分离成纯种的过程纯培养（pureculture）在适宜条件下培养纯种获得的培养物（群体）单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，称为菌落(colony)。菌落一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养；单个微生物只在固体培养基上形成菌落；在液体培养基中不会形成菌落一、用固体培养基（营养琼脂平板）分离纯种微生物样品多种混杂某种方法分散成单个微生物平板培养单菌落每个菌落为纯种（纯培养）单菌落转接培养纯种（纯培养）（一）、微生物纯种分离的原理和方法（二）、纯种平板分离的不同方法从土壤中分离纯微生物104/ml103/ml102/ml101/ml2、稀释倒平板法（倾注平板法）（pourplatemethod)分区划线法（蛇形线法）操作图第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环3、平板划线法（streakplatemethod）分区划线法适用范围：

适用于浓度较大的样品培养严格厌氧微生物4、稀释摇管法（dilutionshakeculturemethod)二、用液体培养基分离纯化培养个别细胞较大的细菌

原生动物、藻类接种物液体培养基顺序稀释法分离营养琼脂平板不能长菌落如何分离纯培养？培养物在液体培养基中进行高度顺序稀释，如果经稀释后的同一稀释度的大多数（95%以上）试管中没有微生物生长，有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。三、单细胞（单孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。个体较小的微生物需采用显微操作仪分离难度与细胞或个体的大小成反比营养琼脂平板上不能形成菌落较大的微生物可使用毛细管提取Eachcolonywasexaminedmicroscopically1、利用选择培养基进行直接分离选择培养基

只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基土壤目的菌优势非目的菌选择培养基直接分离单细胞选择培养基平板（含牛奶或酪蛋白唯一C、N源）37℃培养目的菌落菌落周围有透明蛋白水解圈1、利用选择培养基进行直接分离例一：分离筛选蛋白酶产生细菌人为创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。2、富集培养法富集培养是分离微生物菌种最强有力的技术之一营养选择因子和生理条件选择因子可无穷尽组合，可从自然界选择分离各类特异微生物例：从土壤中分离能产生ß－半乳糖苷酶的微生物富集培养选择培养基分离目的菌验证如果培养物中只含有两种微生物，而且是有意识的保持两者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。五、二元培养物病毒和宿主细胞纤毛虫、变形虫和粘细菌微生物纯培养分离方法的比较方法应用范围稀释倒平板法

涂布平板法平板划线法稀释摇管法液体稀释法单细胞分离法选择培养分离即可定义,又可定量,用途广泛用得最多方法简便,多用于分离细菌主要分离严格厌氧菌适用于培养细胞较大的微生物局限于高等专业化的科学研究适用于分离某些生理类型较特殊的微生物六、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术称为无菌技术。它是微生物研究进行的关键。用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物在转接、培养微生物时防止其他微生物的污染1、所用物品的灭菌技术A、玻璃或金属器皿灭菌高温干热灭菌：干燥箱160－170℃干热空气2h灭菌湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅121℃湿热灭菌30minB、培养基或溶液的灭菌湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅121℃湿热灭菌30minC、血清或生长因子溶液灭菌过滤除菌：细菌滤器滤膜孔径小于细菌细胞的大小上节课知识回顾二、无菌技术单孢子分离选择培养分离二元培养物一、微生物分离纯化方法1、所用物品的灭菌技术玻璃或金属器皿灭菌培养基或溶液灭菌血清或生长因子灭菌2、接种接种:将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种.无菌接种:培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具在无菌条件下将含菌材料接种于培养基上，这个过程叫做无菌接种。1.接种针2.接种环3.接种钩4.接种锄5.接种铲6.接种匙7.接种刀8.接种刀9.剪刀10.钢钩11.镊子12.弹簧接种枪13.接种、枪（日本式）涂布棒弹簧接种枪接种环的灭菌接种环烧红接种环稍冷却接种工具挑选单个菌落划线1、实验台2、空气环境条件七、微生物的保藏技术菌种保藏的原理：根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等条件，使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态。传代培养保藏冷冻保藏干燥保藏纸片保藏薄膜保藏寄主保藏微生物菌株保藏的方法：传代保藏斜面、半固体琼脂柱、液体传代培养保藏斜面：可保存数周至数年，可用石蜡或橡皮塞封口，低温延长保存时间液体：菌苔制成菌悬液，低温（悬液保藏法）缺点：繁琐、易污染、变异丧生原有特性冷冻保藏液氮保藏、低温冰箱等液氮可达－196℃，效果较好注意：速冻，减少冰晶损伤细胞冷冻保藏法细胞体积大的要比体积小的对低温更敏感；无细胞壁的比有细胞壁的更敏感。干燥保藏沙土管保藏、冷冻真空干燥保藏沙土管：产孢子菌。制成孢子悬液，加无菌沙土管，减压抽干水分，石蜡封口，冰箱保存。冷冻真空干燥：加保护剂样品预先冷冻，真空冰升华去水，低温保存，保存数十年，目前最普遍、最重要的方法，菌种保藏中心多采用此法。菌种保藏时采用不同手段保藏，防止某种方法失败导致菌种丧失。干燥保藏法标准菌株的保存使用

1.长期保存的储存菌株以冷冻干燥保藏为主，特殊要求的菌种可用其它方法进行保存，保存期可长达几年至几十年。

2.半储存菌株以含20%甘油的肉汤或液体石腊封存的半固体琼脂为主，在0℃以下保存，保存期为3－6个月。

3.应用菌株以琼脂斜面为主，在4℃保存，保存期为1－3个月。

4.菌种的传代不可超过6次。视菌种的特性及使用情况，一般储存菌株每5年传记代一次，每1-2年从储存菌株转接至半储存菌株，半储存菌株每3-6个月传代一次，每1-3个月从半储存菌株转接接至应用菌株。

5.每次检验用的菌株必须是从应用菌株转接的新鲜菌株。每支应用菌株用两次后必须销毁（121℃，0.1MPa高压灭菌处理15分钟以上）。

国内外菌种保藏部分情况我国于1979年7月成立了中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM).该委员会下设6个菌种保藏管理中心,其负责单位、代号及保藏菌种的性质如下:

普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)--中科院微生物所,北京(AS),真菌、细菌;中科院武汉病毒研究所,武汉(AS-IV),病毒。农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)---中国农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF)。工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)---轻工业部食品发酵工业科学研究所,南京(ID),真菌;卫生部药品生物制品检定所,北京(NICPBP),细菌；中国医学科学院病毒研究所,北京(IV),病毒。抗菌素菌种保藏管理中心(CACC)---中国医学科学院抗菌素研究所北京(IA)；四川抗菌素工业研究所,成都(SIA),新抗菌素菌种;华北制药厂抗菌素研究所,石家庄(IANP),生产用抗菌素菌种。兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)---农业部兽医药品监察所,北京(CIVBP)。除了上述保藏中心外,我国从事微生物研究并保藏有一定数量各类专业用微生物菌种的科研单位、大专院校还有近百所。

世界55个国家的菌种保藏机构共352个,目前主要的菌种保藏机构有:美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。美国“农业研究服务部菌种收藏所”(ARS)设立在“北方地区研究室”(NRRL);荷兰“真菌中心收藏所”(CBS);日本“大阪发酵研究所”(IFO);法国“里