质粒DNA的提取、定量、酶切及PCR鉴定实验报告

..-....word.zl-质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR一、试验目的学习并把握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；学习并把握了解质粒酶切鉴定的方法；学习并把握紫外吸取检测DNA浓度和纯度的原理和方法；PCR基因扩增的试验原理和操作方法；学习并把握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。二、试验原理PCR(多聚酶链式反响)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延长起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延长等步骤，在体外〔缓冲液中〕复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。PCR一次循环的具体反响步骤为：变性：加热反响系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。退火：渐渐降低溶液温度，使合成引物在低温〔35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右〕，DNA互补退火形成局部双链。延长：溶液反响温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTPDNA的一条单链在解链和退火之后延长为一条双链。DNA(1).碱裂解法：DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；当以高盐缓冲液调整其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状构造，可通过离心形成沉沉淀去除。(2).离心层析柱：pHDNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；pH值的洗脱缓冲液将纯洁质粒DNA3.DNA的定量分析〔紫外分光光度法〕：B.各种不同的物质都具有其各自的吸取光谱:DNA260nm280nm的紫外光有特异的吸取峰230nm的紫外光有特异的吸取峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反响DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯洁表示样品中含蛋白质〔芳香族〕或酚类物质A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质〔芳香族〕或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNADNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的根本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特别DNA序列结合，或是与其四周的特异位点结合，并DNA。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNADNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、材料与方法：〔一〕试验材料：1.PCR仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物DNA的提取与制备仪器：恒温培育箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料：溶液P1〔S1〕、溶液P2(S2〕、溶液P3〔S3〕、去蛋白液PE〔W1〕漂洗液WB〔W2〕EB〔Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5αDNA的定量〔紫外分光光度法〕材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡDNA的酶切鉴定..-仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪材料：无菌水、10×MBufR、质粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液〔二〕试验方法1.PCR取0.2mlPCR反响管一只，用微量加样枪按下述挨次分别参加：灭菌去离子水1μl2(101μl5μlPCR反响管置台式离心机中瞬时离心将装有将装有PCR反响体系的PCR反响管放入PCR仪上进展如下操作：①94℃预变性5分钟后开头以下循环②循环为94℃——3050℃——30秒，72℃——1分钟。循环为30次③72℃5分钟④4℃ 保温将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中质粒DNA的提取与制备11.5mlEppendorf管中..-....word.zl-13000rpm13000rpmx1min，弃上清250μlS1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮250μlS24～6次混匀〔不要猛烈振荡〕，直到溶液变得清亮350μlS36~8次。13000rpm10min，留神取上清液〔500-800μl〕将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液参加吸附柱中，13000rpm3min，弃滤液500μl去蛋白液(W1)，13000rpm1min，弃滤液700μlW2，13000rpm1min，弃滤液；重复一遍13000rpm1min3min，使残留乙醇挥发取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl洗脱缓冲液质粒DNA的定量〔紫外分光光度法〕清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿参加适清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿参加适空白比照比色测定向比色皿参加空白比照比色测定向比色皿参加98ul蒸馏水，进展Blank调零质粒DNA的酶切鉴定在一个干净的在一个干净的1.5mlEP管中按挨次依次参加下述试剂9.0μl、10×M酶切1.0μl、EcoRI(12U/ul) 1.0μl留神混匀试剂，将留神混匀试剂，将EP管置于恒温水浴箱中37℃1.5小时。取质粒DNA取质粒DNADNA片段和PCRDNA6μlEP管中并做好标记EP1μlGelview染料，室温放置一分钟30分钟取出凝胶紫外光下观看，拍照.-四、结果与争论：〔一〕试验现象P1，消灭悬消灭象；P2,温顺混匀，溶液会变得清亮；P3,有白色絮状沉淀生成；在紫外检测仪条件下，可以观看到不同的物质消灭不同的电泳带。原始试验数据测量次数质粒DNA浓度〔ug/ml〕Ratio比值(A260/A280)11481.4621061.5231151.45平均值1231.47电泳后的图片. .word.zl-..-....word.zl-〔四〕试验分析Ratio=1.47A260/A280<1.8 说明样品中含有较多的蛋白质〔芳香族〕在图片中，其他三类 DNA与Maker相比较，可知质粒 DNA的分子大小在2500bp-3500bp酶切反响的质粒DNA片段分子大小在2800-3000bp和400-500左右的DNA分子大小在400-500bp。根本符合预期。〔四〕试验争论DNADNADNADNA。这三种不同构型的分子有不同的迁移率，在一般状况下，迁移速度最快的为超螺旋型，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从上到下分别为：超螺旋型DNA、线性分子、开环状分子。,对于试验结果中：A260/A280<1.8的可能缘由为：在质粒DNA的提取试验的“取上清液”步骤中吸入沉淀导致引入较多的蛋白杂质，进而导致后续试验中因蛋白质量较多而难以去除。3.试验中需留意的事项：吸头。在PCR中，假设配好的反响液较多沾到管壁上，要将PCR反响管置台式离心机中瞬时离心，使反响液集中于管底，然后才将反响管放到基因扩增仪上。DNA提取的试验中，参加溶液S2次。在电泳中，Geldview有毒，切勿用手接触。思考题：I、II、III答：IDNAII：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液IIDNA-SDS+线性DNANa+可中和DN