利福霉素的发酵提炼合成

提炼车间学习1、岗位主要内容或任务1）、生产管理：负责编写相关车间生产管理文件和审核生产操作和设备的操作、清洁的操作文件；监督检查车间员工对各自岗位的工作职责、操作规程的执行情况，以及当日岗位工作生产任务完成情况；负责初步审核已完成的批生产记录及批包装记录。2）、生产培训：负责对各生产岗位员工的法规、管理文件及实际操作的培训工作。3）、生产技术：会同有关部门进行相关生产设备的验证、生产工艺验证工作；4）、组织生产：按生产部下达的生产指令组织生产，按时完成生产任务并对产品质量负责。5）、生产安全：负责生产现场的管理工作，按程序处理生产中的各种事故和偏差；及时发现事故、隐患，杜绝各类生产安全、质量事故的发生。2、生产工艺利福霉素钠属安莎类抗生素，是半合成的利福霉素中的广谱抗生素，也是国内惟一供注射用的利福霉素类药物，对金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌有较强的杀菌作用。是目前临床九大抗结核药物的首选药物。由于利福霉素钠结构复杂、不稳定、容易产生降解杂质，主要杂质为利福霉素S与利福霉素B，其含量测定法目前各国一般采用微生物检定法，但微生物检定法专属性较差，且操纵繁杂、费时。利福霉素钠的HPLC含量测定方法未见相关文献报道。作者建立了一种高效液相色谱法测定利福霉素钠的含量。该方法简便、快速、精密、准确，并能同时测定其有关物质。该HPLC方法测定有关物质时较《英国药典》方法简便，专属性强，能分离出更多的杂质，结果满意。该方法亦可用于利福霉素钠制剂的测定。1)、生产工艺生产涉及一种原料药物的生产工艺，特别是一种新的利福霉素钠的生产工艺。利福霉素钠为利福霉素半合成品，目前的生产工艺落后，利福霉素钠收取率低。本发明为了克服目前的生产工艺利福霉素钠收取率低和生产工艺过程不稳定问题，而提供一种新的生产工艺。本发明是这样实现的，路线以利福霉素S为原料，经维生素C还原成利福霉素SV,再与碳酸氢钠成盐，制得利福霉素钠。其工艺还原－取精－干燥－包装，以及废液、废渣处理工艺过程都进行了革新。本发明生产工艺过程极其稳定，利福霉素钠收取率高，特别是成品中杂质利福霉素S的含量由以前的2%降到现在的0.8%，很大程度上提高了产品的纯度，从而生产出性能更加稳定的利福霉素钠。2)、主要技术指标一种新的利福霉素钠的生产工艺，工艺过程为还原－精制－干燥－包装，以及废液、废渣处理，其特征在于，所述的还原工艺的投料比为：利福霉素S：乙酸丁酯：纯化水：维生素C：碳酸氢钠：硫酸：硅藻土：活性碳：氢氧化钠=40-70(kg)：400-700(kg)：80-130(kg)：9-13(kg)：8-12(kg) (+纯水80—100kg)：2—5(L)(+纯水20-40kg)：2-5(kg)：1-3(kg)：4-6(kg)(+纯水100—200kg)还原工艺过程为：(1)向搪玻璃反应罐中加入乙酸丁酯和纯化水，搅拌下缓慢升温并缓慢加入维生素C,升温至25—35t；(2)待维生素C全溶后，缓慢地加入利福霉素S,加料过程中，温度控制在25—35T，保温40—50分钟，用薄层层析检查反应终点，主斑点上端无红色斑点即反应完全；(3)反应完全后，搅拌下将已配好的碳酸氢钠溶液缓慢加入，于30—40T搅拌保温90—120分钟；(4)保温毕，将已稀释好的酸液缓慢加入，于40—45T搅拌30—60分钟后停搅拌，静置30—60分钟；(5)静置后，分去下层水，搅拌下加入硅藻土和活性碳，继续搅10—20分钟后，放料抽滤；所述的精制工艺为：精制投料比为：利福霉素S：纯化水：氢氧化钠：=50—80(kg)：90—120(kg)：4—6(kg) (+纯化水40—80kg)；精制工艺过程为：(1)搅拌下将滤液、纯化水及氢氧化钠溶液抽入精制罐内，并于40—45T搅拌下保温1—3小时后降温至8T以下，静置；(2)放料甩滤，用少量乙酸丁酯淋洗滤饼，分离40—60分钟后出料，称重，待烘。控制湿精品干燥失重W30%；干燥工艺过程为： 将湿料装入烘盘内并摊匀，置入烘箱于W80t，真空度W—0.085Mpa干燥60—90分钟，收料、打粉、称重，控制好干燥温度及时间，确保干燥失重在合格范围内，干品水分在12．0—17.0% ；所述的包装工艺过程为：干品经检验合格后方可包装，每机最大量500kg最佳混合时间60分钟；标准量300kg最佳混合时间30分钟；最小量100kg最佳混合时间30分钟；双层塑料袋密封，每桶25kg或20kg，取样后，用扎口绳将塑料袋口分别扎紧进行包装。3、主要设备结构及功能发酵法生产抗生素的主要工艺步骤包括菌种的制备、种子扩大培养、发酵发酵液的预处理、代谢产物的分离纯化、干燥，最后制得产品。生产的一般工艺流程简图：消沫剂! 菌丝体一综合利用t冷冻干燥孢子一琼脂斜面孢子一米孢子一种子罐一发酵罐一过滤一回收t补料（前体、氮源、碳源）4、工业三废及处理方法利福霉素生产废水主要是提取废水、洗涤废水和冷却水排污等其他废水等。该类废水成分复杂,有机物、溶解性或胶体性固体物浓度高,悬浮物含量高,pH经常变化,带有暗红色和黄色物质及酯类气味，含有难生物降解和抑菌作用的抗生素等生物毒性物质。根据发酵制药行业废水水质特点,目前国内没有单独处理此类废水的装置,一般是将高浓度废水和低浓度废水混合后采用生物处理为主，辅以物理、化学方法的工艺进行处理。本文以“内电解+CASS+接触氧化+气浮”废水处理工艺加以讨论。一、工艺流程河南省某生产利福霉素S-Na盐的企业，位于淮河流域，年产量160t/a，日排综合废水600m3/d，经现状监测，综合水质为:COD浓度11620mg/l,B0D为1356mg/l,SS为1356mg/l,氨氮为126mg/l,总锌9.4mg/l,色度6000。为了使工程废水达标排放,选择技术先进、成熟的“内电解+CASS+接触氧化+气浮”处理工艺。5、安全生产措施各项目部的安全生产由项目经理负责，各级项目部门主管分工负责。安全生产作为项目部各级领导业绩，晋升的主要考核内容。项目部要加强各级主管，员工安全生产知识和安全操作的学习。新员工进入岗位前，必须经过安全知识的学习。对于工种变动和多面手的员工要根据变动的工种进行安全知识的学习。各部门应坚持安全知识的宣传和教育，天天讲、月月讲，做到安全生产知识深入人心，落实到人。坚持遵章守纪，严禁违章指挥和违章操作。坚持实行安全检查制度，每月进行一次安全生产检查，各部门主管应坚持每月一次自查。在检查过程中，纠正违章，发现不安全隐患及时解决。教育员工要加强自我保护意识，能力，对不科学，不安全，无防护措施的冒险蛮干和指令有权拒绝执行并提出合理化建议。工程部驻地用火须配备足够的消防用品。向仓库领取和使用易燃，易爆，剧毒物品时，要经部门主管同意签字，物品用后应妥善保管或交回仓库，不得随意乱放或接近电源、火源、热源、水源等。材料库，易燃、易爆设备和易燃建筑物附近禁止堆放易燃、易爆物品，并在其周围杜绝火源。维修机械，车辆和工作用后的油污品应集中存放和销毁。装卸，搬运和使用易爆品时应防止撞击、摩擦、重压。员工宿舍、办公室、磅房等公共场所严禁存放易燃、易爆，剧毒物品。汽车司机要随时检查车辆，确保电源火线绝缘套管不被挤压，防止电路短路起火。所有车辆应备有足够的消防器材并保持其良好有效。各种设备在维修清理前，应先断电，清理油箱。严禁使用易燃物品擦拭设备。在使用易燃物品时，附近严禁明火出现。材料库的物品存放要有序整齐。易燃，易爆物品的存放要分门别类，防止混合存放。易燃、易爆物品要注意温度，超温要及时汇报部门主管。材料库内保持清洁、通风、干燥。疏散门不得堵塞。合成车间一、溶媒回收岗位标准操作规程内容检查贮罐储蒸罐精馏罐及温度计，液位计，罐面灯泵阀门正常，作状态标示打开母液贮罐进料阀，启动母液罐打料泵，将母液贮罐，静至过夜初烝分水关贮水罐排空阀，进料阀，真空阀，将母液贮罐下层水抽入贮水管后，关进料罐真空阀开排空阀蒸馏关蒸馏罐排空阀，开进料阀将母液贮罐中已分去的母液抽入罐内至标定位置，关进料阀，开蒸馏罐夹层蒸汽阀，排气阀，开冷凝器冷却水进，出水阀，开排空阀进行蒸馏，将罐内料液成稠状，关蒸汽阀冷凝器进，出水阀，开排空阀。趁热将管内物料放下冷却为块状，集中焚烧精馏关精馏罐排空阀，开进料阀真空阀，将初烝收集的料液抽入精馏罐，开夹套蒸汽阀，排空阀，冷凝器进，出水阀进行精馏甲醇收集64-67度（塔顶温度）馏分为精品，68-82度馏分套入下批精馏，塔顶温度达82度后，关蒸汽阀，冷凝器进出水阀，停止蒸馏，罐内残液放入废池乙醇收集75-81度（塔顶温度）馏分为精品，82-86度馏分套入下批精馏。塔顶温度达86度后，关蒸汽阀，冷凝器进，出水阀，停止蒸馏罐内残液放入废水池正丁醇乙酸丁酯，开分液阀，将上层溶媒回流分去水层，收集塔顶温度达115-119度馏分（正丁醇），124-127度馏分（乙酸丁酯）的为精品将贮水罐的水抽入精馏罐，开分液阀收集上层溶媒，直至收集不到溶媒为止，停止蒸馏，关蒸汽阀，冷凝器进，出水阀，管内残液放入废水池收集的溶媒套入精馏、利福平水洗岗位标准操作规程操作过程上岗前穿戴好劳动防护用品，打开罐面灯，检查嗪水罐内清洁及搅拌，罐底阀正常，挂好状态标志清水放入水洗灌指标定位置，开动搅拌开搅拌将称量好的冰乙酸加入到水洗罐中，打开水洗灌真空进阀，将环合液抽入水洗灌，环合液抽完后关真空阀，搅拌5分钟，停止搅拌，静止30分钟以上分离检查离心机并且清洁，无破损，再将厚薄滤袋依次铺付贴于转鼓内打开水洗灌底阀，按《离心机标准操作规程》启动离心机，待运转正常后缓缓打开放料阀并控制好流量，观察机内液面变化，当液面接近拦液板1厘米时关闭放料阀防止益料，可分数依次放料，料放完全，停止搅拌用水冲洗罐壁，洗灌水放入离心机内甩率，关罐面灯分三次放料，每次放料完毕后分离10分钟，再用饮用水淋洗机内的物料15分钟再分离30分钟，按离心机标准操作规程停机出料称重标识按本岗位清场操作规程进行清场，作状态标识三、利福平缩合岗位标准操作规程操作过程上岗前穿戴好劳动防护用品，打开罐面灯，检查反应罐内清洁，温度计，罐底阀，夹套阀，计量器具正常，挂好状态标识关计量罐排空阀，开真空阀，开正丁醇进料阀，使罐内液升温至25度到3度，打开罐盖加入湿将称量好的维生素cNa2co3尿素依次缓缓加入反应罐内，加热至68度，开始计时，保温68-72度，保温时间90-95分钟启动搅拌开夹套排气阀，缓缓打开蒸汽进阀按《薄层层析自检操作规程》检查反应终点，层析板由工艺员判断反应终点，以红色斑点占主斑点面积75%以上，即为开环达标，否则可适当延长时间10-30分钟开夹套出水阀，关排气阀开进水阀降温，温度降至为67度，关闭进水阀，开启排水阀和排空阀，将称量好的侧链加入反应罐中，保温在60-65度，反应60-70分钟按《薄层层析自检操作规程》检查反应终点，层析板由工艺员进行终点判断，以无蓝色斑点为反应完全，若反应不完全应延长时间或加适量侧链，反应毕，按程序再进行自检。停止搅拌，打开抽滤罐盖检查滤袋清洁无破损后铺伏贴于抽滤罐内，将粗精岗位打开抽料阀后再打开反应罐底阀进行抽滤抽滤结束用约10l正丁醇淋洗罐壁，并过滤后关罐底阀，关罐面灯按本岗位操作规程进行清场，作状态标志操作要求开环温度控制在68-72度，按测温度应控制在60-65度薄层层析终点判断由技术人员审核根据薄层层检查情况可适当增补侧链延长反应时间（0.5-2分钟,10-30分钟）抽滤袋应清洁无破损发酵车间综述：利福霉素(rifamycins)是由地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)产生的一类安莎(ansamycins)大环内酯抗生素。这类抗生素的毒性低、疗效高且抗菌谱较广，可特异性地与依赖DNA的RNA聚合酶作用，抑制细菌DNA的转录过程；而且对肿瘤RNA病毒的依赖RNA的DNA逆转录酶有抑制作用。广泛应用于治疗G+(革兰氏阳性菌)、结核病、麻风病和与艾滋病有关的分枝杆菌感染。利福霉素简介：利福霉素是1957年由意大利Lepetit研究室Sensi等发现的，他们从地中海拟无枝酸菌的培养液中可以得到利福霉素A、B、C、D、E五种组分，其中主要组分为B组分，后来人们又在不同产生菌菌种的发酵液中发现了利福霉素0、S、SV组分。利福霉素成员虽多，但抗菌活性不一，有实用价值者甚少，只有利福霉素SV应用于临床。利福霉素B活性虽较小，但却很容易转化为其他活性较高的衍生物，如利福霉素0、S、SV,转化关系如下：利福霉素的化学结构：利福霉素各结构组分上的差异只在于芳香核上侧链的不同。生产菌种：利福霉素产生菌是1957年米兰研究室从法国拉斐尔植物国土样中分离筛选获得，当时将其分类为地中海链霉菌，属于放线菌。后来根据生物化学分类法划入诺卡式菌属（因其细胞壁化学组成有消旋二氨基康二酸、阿拉伯糖、半乳糖），并更正为地中海诺卡式菌。后来将这一类菌单列一属，改名为地中海拟无枝酸菌。除地中海拟无枝酸菌外，相继从链霉菌、诺卡式菌属和小单孢菌属分离出利福霉素产生菌。从地中海诺卡式菌的突变菌株得到一系列的利福霉素，如利福霉素W、利福霉素P、利福霉素Q、利福霉素R、利福霉素Z、37-去甲基利福霉素SV、27-去甲氧基利福霉素B等。其中拟无枝酸菌突变株U-32可合成利福霉素SV.利福霉素SV理化性质及其衍生物：利福霉素SV为有光泽的橘黄色结晶，是强一元酸，PK=2.96.其钠盐为橙红色结晶性粉末，无臭、味苦，二者微溶于水，易溶于有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。利福霉素SV的分子式为C37H47012,分子量为689.7。利福霉素SV是一种新型的广谱抗生素，特别是对金黄色葡萄球菌和结核杆菌的抗菌活性高于青霉素，1962年用于临床。利福平就是以利福霉素SV为原料合成出来的一种较好的药物。由于利福霉素SV的口服吸收效果差，于是研制出了利福平（亦称甲哌利福霉素）、利福米特（亦称利福霉素B二乙基胺）等半合成抗生素。这些衍生物对革兰氏阳性菌和结核杆菌有很强的抑制作用。还发现这类抗生素对依赖于DNA的RNA聚合酶或诱导肿瘤的RNA病毒的逆转录酶有抑制作用。利福霉素SV合成利福平流程：

利福平甲BHt反应1980年安莎类抗生素的典型代表-利福霉素S甲BHt反应1980年安莎类抗生素的典型代表-利福霉素S全合成出现，这利福霉素W是第一个分离到的利福霉素S的前体，地中海拟无枝酸菌合成利福霉素S后经修饰可生成各种利福霉素（利福霉素A、B、C、D、E、SV、L、O、Y、G、R、P、Q、Verde）。利福霉素SV是利福霉素菌种（诺卡氏菌）发酵刺激代谢产生的分泌物，其产量、质量和菌种性能关系较大，要想使利福霉素SV产量和质量有较大提高，首先要提高菌种的性能，要想使菌种生产能力不断提高，最根本还的依靠菌种本身固有的遗传特性，必须不断进行菌种选育、改良。目前，国内工业微生物育种工作效率低，利福霉素SV的发酵水平不高，平均发酵水平在5000“g/ml左右，若能将发酵单位提高10%以上，则利福霉素SV的产量提高10%以上,利福霉素SV生产企业获得利润至少增加10%。利福霉素系列产品：利福平，分子式C43H45N4012分子量822.95，橙红色片状结晶或砖红色结晶粉末。利福平是从利福霉素B/SV得到的一种半合成抗生素利福霉素SV,利福霉素钠药物别名利福霉素SV。利福霉素S,分子式：C37H45N012分子量695.15，黄色或橙黄色结晶粉末。利福霉素B，分子式：C39H49N014分子量755.82,黄色菱形或针状结晶。利福霉素Na,分子式：C37H46NaN012分子量719.16，红色结晶粉末。利福霉素S-Na盐，分子式：C37H44NaN012分子量717.75。利福昔明，分子式：C43H51N3011分子量785.88。利福霉素衍生物。利福布汀，（安莎霉素）分子式：C46H62N4011分子量847。为利福霉素的螺旋哌啶衍生物，对结核杆菌的抑菌作用比利福平约强4倍。利福霉素O利福定（异丁哌力复酶）利福霉素B二乙酰胺、总过滤器灭菌当蒸汽总管路上的压力为0.2-0.25MPa时,打开总过滤器进气阀输入蒸汽,同时打开出气阀的跑分阀、排气阀、排污阀,当三个阀均排出蒸汽时，调整进气阀、排污阀，稳定总过滤器压力0.15-0.2MPa，此时打开压力表下跑分,计时灭菌2-2.5小时.灭菌结束后启动空压机,当空气输入管道压力大于总过滤器压力时，关闭蒸汽阀，打开空气阀，将空气出入总过滤器，然后调整进气阀与排污阀，稳定总过滤器压力在0.15-0.2MPa,保持通气在15-20小时，当出气阀跑分和排污阀放出的空气为干燥空气时，完成灭菌.二、分过滤器灭菌1当蒸汽管路压力为0.2-0.25MPa时，打开蒸汽过滤器的进气阀和排污阀，当蒸汽管路中无蒸汽凝结液后，再将蒸汽输入空气管路，然后打开分过滤器的进气阀、排污阀及出气阀上的跑分，当所有阀门均有蒸汽排出后，调整进气与排污阀，是压力稳定在0.11-0.15MPa,计时灭菌30-35分钟.灭菌结束后，关闭蒸汽过滤器进出气阀、排污阀，并立即将空气输入预过滤器，使空气通过预过滤器进入到分过滤器，再调整分过滤器排污阀使压力稳定在0.11-0.15MPa，备用。三、发酵罐空消（可与分过滤器灭菌同时进行）空消前先将发酵罐去垢洗净，添加少量清水，然后密封进料口，将排气阀打开少许，同事将蒸汽引入盘管（或夹套）进行预热，待罐温升到80°C时（种子罐40°C即可），关闭盘管（或夹套）进气阀，再从出料口、进气口、取样口三路输入蒸汽,（蒸汽管路压力不低于0.2-0.25MPa）,当罐内温度达到125-130°C时，通过三路蒸气浴出气阀调整罐内压力，使其稳定在0.11-0.15MPa,计时灭菌30-35分钟.空消结束后，关闭所有进气阀并将排气阀开大，当罐内压力下降至0MPa后，打开进料口和排污阀,再将发酵罐进行一次冲洗。四、发酵罐实消打开进水阀,按照生产要求放入所需水量,再根据生产品种按配方依次投入培养基原料,并同时打开搅拌,搅拌5-10分钟后取样,用氢氧化钠和浓盐酸调PH值7.2-7.5之间，然后密封进料口将排气阀打开少许,同时打开盘管（或夹套）的进出气阀门输入蒸汽进行预热,等到罐内温度到达80C以上后，关闭盘管（或夹套）进气阀门,并将排气阀关小,然后将蒸汽从进气口、出料口、取样口三路直接通入罐内,当罐内温度上升到121-125C后,打开发酵罐体上与空气进气阀上的所有跑分,再通过调整三路进气与排气阀将罐内压力稳定在0.11-0.15MPa,此时开始计时灭菌30-35分钟,灭菌期间将搅拌停止.灭菌结束后,关闭所有进蒸汽阀门,将排气阀开大,同时开启搅拌,并立即打开进气阀,输入无菌空气，保证罐压不低于0.05-0.06MPa（当发酵罐通入无菌空气后,一定注意分过滤器与空气总管路压力一定要大于发酵罐内压力）,打开盘管（或夹套）冷却水进出阀门（确定蒸汽出阀门关闭）,开始降温，按照不同菌种接种温度要求控制降温结束时间（一般在34C左右）,降温结束后即可接种。五、接种1种子罐接种先将进气阀逐渐关闭,同时将排气阀开大,当罐体压力表与空气流量计降到0