无菌操作和接种技术

无菌操作和接种技术第1页/共24页条件结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线消毒法和化学药剂消毒法灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌第2页/共24页1、煮沸消毒法：可用于饮水和一般器械（刀剪、注射器等）的消毒。2、紫外线消毒法：是利用照射紫外线杀灭微生物的一种方法，用于空气及一般物品表面消毒。照射人体能发生皮肤红斑，紫外线眼炎和臭氧中毒等。故使用时人应避开或用相应的保护措施。3、化学药剂消毒法：体积分数为70%的乙醇杀菌效果最好（手）一、消毒方法第3页/共24页

4、

巴氏消毒法：是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法。常用于消毒牛奶和酒类等。

来源于巴斯德解决啤酒变酸的问题。当时，法国酿酒业面临着一个令人头疼的问题，那就是啤酒在酿出后会变酸，根本无法饮用。而且这种变酸现象还时常发生。巴斯德受人邀请去研究这个问题。经过长时间的观察，他发现使啤酒变酸的罪魁祸首是乳酸杆菌。营养丰富的啤酒简直就是乳酸杆菌生长的天堂。采取简单的煮沸的方法是可以杀死乳酸杆菌的，但是，这样一来啤酒也就被煮坏了。巴斯德尝试使用不同的温度来杀死乳酸杆菌，而又不会破坏啤酒本身。最后，巴斯德的研究结果是：以50~60℃的温度加热啤酒半小时，就可以杀死啤酒里的乳酸杆菌，而不必煮沸。这一方法挽救了法国的酿酒业。这种灭菌法也就被称为“巴氏灭菌法”。

第4页/共24页二、灭菌方法1、灼烧灭菌：直接用火焰杀死微生物，适用于微生物实验室的接种针、接种环等接种工具及器皿的灭菌。2、高压蒸汽灭菌（原理：高温使蛋白质和核酸变性）利用适当温度和压力的饱和水蒸汽加热杀灭微生物的一种方法。用于水、培养基、纱布、玻璃器材等耐高温高压潮湿的物品的灭菌3、干热灭菌：是利用干热空气加热杀灭微生物的一种方法（电烘箱），常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。第5页/共24页

怎样验证培养基的制作是否合格？如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天后无菌落生长，说明培养基的制备是合格的，否则需要重新制备。第6页/共24页1、细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌 (

)

A．接种环、手、培养基

B．高压锅、手、接种环

C．培养基、手、接种环

D．接种环、手、高压锅C第7页/共24页2．据调查，市场上销售的绝大部分鸡蛋都没有经过清洗，更谈不上消毒，表面经常残留羽毛、粪便、饲料等脏物，还可能带有沙门氏菌、大肠杆菌，甚至会造成禽流感病毒传播，美国《蛋制品检查法》将表面污浊的鸡蛋列为“脏蛋”且禁止上市。下列相关叙述错误的是 (

)

A．生物学意义上的灭菌、消毒和防止杂菌污染各有不同的含义

B．由于鸡蛋、奶等食品中的某些成分不易在高温下被破坏，对其可采取高温灭菌

C．巴氏消毒法就是加热到70～80℃，保持15～30min，能杀死一般杂菌和病原菌

D．高温灭菌的原理是高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动B第8页/共24页3．关于灭菌和消毒理解不正确的是 (

)

A．灭菌是指杀灭环境中的一切微生物，包括芽孢和孢子

B．消毒和灭菌实质上是相同的

C．接种环用灼烧法灭菌

D．常用的灭菌和消毒方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法B第9页/共24页

4、氯苯化合物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验方案(图1)筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培养基配方如表1。第10页/共24页(1)配制Ⅱ号固体培养基时，除添加Ⅱ号液体培养基成分外，还应添加1%的________。

(2)培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是________________。(3)从用途上来说，Ⅰ号培养基和Ⅱ号培养基分别属于________培养基和________培养基。在Ⅱ号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是________。(4)在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为________。琼脂先调PH后灭菌基础选择硝酸铵芽孢第11页/共24页(5)将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的Ⅲ号培养液中培养，得到生长曲线(如图2)。从图2可知，SP1菌在________培养条件下最早停止生长，其原因是________________。20mg/L碳源最早耗尽第12页/共24页三、分离纯化某种微生物的接种技术-------平板划线法、稀释涂布平板法第13页/共24页1、平板划线法：平板划线法中细菌的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的移动划线过程中。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落（由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体）。注意a．划线时最后一区域不要与第一区域相连。

b.划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。第14页/共24页第15页/共24页2、稀释涂布平板法注意：接种时每个浓度至少设置3个重复，倒置培养统计菌落时，选菌落数为30～300的一组为代表进行统计每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数。第16页/共24页1、通过实验测定土壤中的细菌数量，下列与此操作有关的叙述中，不正确的 ()A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B．取10－4、10－5的土壤稀释液0.1mL，分别涂布于各组平板上C．将培养皿倒置，37℃恒温培养24～48小时D．选择菌落数在300个以上的培养皿进行计数D第17页/共24页2.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是 (

)

A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230

B．涂布了两个平板，统计的菌落数分别是215和260，取平均值238

C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212、256，取平均值163

D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233D第18页/共24页3．在下列选项中，需要采用植物组织培养技术的是 ()①利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，获得多倍体植株②获取大量的脱毒苗③利用基因工程培养抗棉铃虫的植株④单倍体育种⑤无子西瓜的快速大量繁殖A．①②③ B．③④⑤C．①②④⑤ D．②③④⑤D第19页/共24页

4、下列关于MS培养基与微生物培养基的配方相比，不同之处说法错误的是 (

)

A．MS培养基中常常添加植物激素，微生物培养基中不需要

B．MS培养基中的碳源和能源是蔗糖，微生物培养基中的碳源和能源主要是葡萄糖

C．MS培养基中需提供植物生长必需的大量元素和微量元素

D．MS培养基中不需加维生素，微生物培养基中要加维生素作生长因子D第20页/共24页5．白僵菌高孢粉是国家林业局推广的高效生物杀虫剂之一，应用于多种林木和农作物害虫的防治。白僵菌分生孢子附着在寄主表皮、气孔或消化道上，遇适宜条件开始萌发，生出芽管。同时产生脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶等溶解昆虫的表皮，通过芽管入侵虫体，在虫体内生长繁殖，消耗寄主体内养分，产生各种毒素，形成大量菌丝和孢子，布满虫体全身。请回答下面的问题：(1)从自然菌样中筛选较理想生产用菌种的一般步骤：采集菌样―→富集培养―→________―→性能测定。白僵菌的菌样应从________处采集。(2)分离白僵菌菌种的培养基属于__________培养基。在配制白僵菌培养基时常加入蔗糖、硫酸铵、硝酸钾等成分，蔗糖属于__________营养物质。

(3)白僵菌纯培养常用的接种方法是______________和______________。(4)分离与培养过程中，培养基和接种工具都要进行______处理，利用高温可以使微生物的________等物质发生变性。纯种分离选择碳源稀释涂布平板法平板划线法灭菌蛋白质和核酸感病昆虫第21页/共24页6、(2011·新课标全国卷，39)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属于__________培养基。(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即________________和________________。(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力__________。(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和________。无菌技术要求实验操作应在酒精灯________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。原油选择