病原微生物生理学检验

病原微生物生理学检验第1页，共40页，2023年，2月20日，星期一（一）培养基由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。

第一节分离培养一、细菌的分离培养第2页，共40页，2023年，2月20日，星期一1.培养基种类基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基特殊培养基包括厌氧培养基和细菌L型培养基等。碱性琼脂血液增菌培养基营养肉汤第3页，共40页，2023年，2月20日，星期一分离培养基的选择依据卫生部临床检验中心推荐，应备有如下分离培养基：

1．血平板

2．巧克力血平板

3．中国蓝平板或伊红美蓝平板

4．麦康凯平板

5．SS琼脂第4页，共40页，2023年，2月20日，星期一2.培养基的组成成分营养物质凝固物质抑制剂和指示剂第5页，共40页，2023年，2月20日，星期一第6页，共40页，2023年，2月20日，星期一(二)细菌的接种方法

1.平板划线分离法

1)连续划线分离法

2)分区划线分离法第7页，共40页，2023年，2月20日，星期一2.斜面接种法3.液体接种法4.穿刺接种法5.倾注平板法6.涂布接种法第8页，共40页，2023年，2月20日，星期一(三)细菌的培养方法

1.需氧培养法2.二氧化碳培养法

1)二氧化碳培养箱

2)烛缸法

3)化学法3.厌氧培养法第9页，共40页，2023年，2月20日，星期一1．动物接种动物对病毒的敏感性是不同的，选择合适动物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。二病毒分离培养第10页，共40页，2023年，2月20日，星期一2．鸡胚接种鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料组织培养是指将人或动物离体的活组织或分散的活细胞放在实验室的试管或培养瓶中,模拟体内的生理条件使之生长第11页，共40页，2023年，2月20日，星期一

2.组织细胞培养根据细胞的来源、特性和传代次数分为：

(1)原代细胞培养：将细胞悬液加入营养液培养，形成的单层细胞，称之为原代细胞。

(2)二倍体细胞株：仍保持二倍体特性。寿命一般为40～50代，如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。

(3)传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)。第12页，共40页，2023年，2月20日，星期一三、真菌的分离培养1.大培养2.小培养

(1)玻片法

(2)钢圈法

(3)方块法第13页，共40页，2023年，2月20日，星期一第二节毒素的检测一、细菌内毒素的测定主要用于诊断病人是否发生革兰阴性细菌感染。另外，还可用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染第14页，共40页，2023年，2月20日，星期一

1．细菌内毒素的致热作用常以家兔作为实验动物，家兔正常体温38.5℃～40℃。抽取被检物注入家兔耳静脉，记录体温变化情况，分析实验结果第15页，共40页，2023年，2月20日，星期一

2．鲎试验鲎血液的有核变形细胞内含凝固酶原及凝固蛋白原，当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物(鲎试剂)接触时，可激活凝固酶原，使可溶性的凝固蛋白原变成凝胶状态的凝固蛋白，利用此种反应来检测内毒素。本试验对内毒素具有高度特异性，灵敏度高，可检查出0.005～0.0005μg/ml内毒素。且操作简便，速度快，在2h内即可得出结论。第16页，共40页，2023年，2月20日，星期一二、外毒素的测定

1．体内毒力试验细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。第17页，共40页，2023年，2月20日，星期一

2．体外毒力试验外毒素抗原性强，可刺激机体产生相应的抗体。在体外以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒素(抗原)进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是否产生该种毒素。如白喉棒状杆菌的Elek平板毒力测定３．ELISA法如葡萄球菌肠毒素、肠产毒型大肠埃希菌LT及ST等的测定第18页，共40页，2023年，2月20日，星期一第三节生化反应不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌第19页，共40页，2023年，2月20日，星期一

1．糖(醇、苷)类发酵试验

(1)原理：由于细菌含有发酵不同糖类的酶，故分解糖的能力不同，终末产物亦不一致。有的能分解，有的仅能分解1~2种，还有的不能分解。有的产酸产气，有的仅产酸，故可利用鉴别细菌第20页，共40页，2023年，2月20日，星期一

(2)培养基：在培养基中加入0.5％-1％的糖类(单糖、双糖或多糖)、醇类(甘露醇、肌醇等)、苷类(水杨苷、菊糖等)。可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型

(3)方法：将细菌接种到糖发酵培养基中，培养数小时至2w后，观察结果第21页，共40页，2023年，2月20日，星期一

(4)结果：能分解糖产酸时，呈酸性反应，若产气可出现气泡或培养基内有裂隙等现象;若不分解，除有细菌生长外，无任何变化

(5)应用：是鉴定细菌最主要的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要第22页，共40页，2023年，2月20日，星期一

2．V-P试验(1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，脱羧产生乙酰甲基甲醇，在碱性环境中被氧氧化为二乙酰，进而与胍基起作用生成红色化合物，则为V-P试验阳性。(2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。第23页，共40页，2023年，2月20日，星期一(3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养48h后加入甲液(6％n·萘酚酒精溶液)和乙液(40％KOH溶液)，振摇。(4)结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于35℃4h后仍如故者即为阴性。(5)应用：常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。

第24页，共40页，2023年，2月20日，星期一3．甲基红试验(1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解，产生甲酸等，使pH降至4.5以下，加入甲基红试剂则呈红色为阳性。若分解葡萄糖产酸量少，则pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。第25页，共40页，2023年，2月20日，星期一(2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。(3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养2~4d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。(4)结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。第26页，共40页，2023年，2月20日，星期一(5)应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属则为阴性。第27页，共40页，2023年，2月20日，星期一4.枸橼酸盐试验(Simmons法）

原理:枸橼酸盐利用试验是检测细菌能否利用枸橼酸盐作为碳的唯一来源的特征，培养基含有枸橼酸钠和磷酸二氢胺

结果：培养基由绿色变为深蓝色为阳性

用途：用于肠杆菌科内各种细菌的鉴别第28页，共40页，2023年，2月20日，星期一5.丙二酸盐试验某些细菌以丙二酸盐为唯一碳源，生成碳酸钠使培养基变碱性阳性结果蓝色溴麝香草酚蓝第29页，共40页，2023年，2月20日，星期一6.氰化钾抑制试验原理：检测细菌能否被一定浓度的氰化钾抑制而不能生长结果：不能生长为阳性培养基：含氰化钾用途：鉴别与沙门菌属、痢疾杆菌属相类似的肠道杆菌第30页，共40页，2023年，2月20日，星期一7.硝酸盐（Nitrate）还原试验有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，有效菌可进一步分解亚硝酸盐产生氨或氮气等。本试验阴性的原因：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解；培养基不适宜细菌生长。第31页，共40页，2023年，2月20日，星期一加锌粉检验。加锌粉——红色，说明产生芳基肼，硝酸盐还在。无红色时，说明以分解氨和氮，也可加倒管收集气体。第32页，共40页，2023年，2月20日，星期一

原理:检测细菌能否分解色氨酸而产生靛基质

培养基：含有色氨酸

结果：形成玫瑰靛基质（红色）

用途：鉴别肠道杆菌8.靛基质（Imdole）试验第33页，共40页，2023年，2月20日，星期一9.H2S试验原理：检测细菌能否产生H2S培养基：含醋酸铅硫酸亚铁氯化亚铁或枸橼酸铁结果：形成黑色沉淀物用途：鉴别肠道杆菌的种类第34页，共40页，2023年，2月20日，星期一原理：检测能否产生脲酶培养基：含有尿素结果：培养基变碱性，呈红色用途：肠道杆菌等的鉴定10.尿素酶（Urease）试验第35页，共40页，2023年，2月20日，星期一11.明胶液化试验原理：检测细菌能否产生胶原酶培养基：明胶结果：半固体的明胶变为流动液体状态用途：肠杆菌科细菌的鉴定第36页，共40页，2023年，2月20日，星期一12.氧化酶（Oxidase）试验

原理：检测细菌是否具有氧化酶

培养基：含有二甲基对苯二胺

结果：形成红色化合物

用途：鉴别肠杆菌科细菌与假单胞菌第37页，共40页，2023年，2月20日，星期一13.触酶试验原理：检测细菌是否具有触酶的特性结果：具有触酶的细菌能催化过氧化氢生成水与新生态氧，形成呢个分子氧出现水泡，为触酶阳性用途：革兰阳性球菌的初步分群第38页，共40页，2023年，2月20日，星期一

14.苯丙氨酸脱氨酶试验

原理方法将细菌大量接种于上述培养基斜面，在35℃