现代生物技术细胞工程

现代生物技术细胞工程第1页，共136页，2023年，2月20日，星期日一、细胞工程的内容根据其研究对象不同，分为植物细胞工程、动物细胞工程和微生物细胞工程。细胞是细胞工程操作的主要对象。原核细胞细菌、放线菌真核细胞酵母菌、动物细胞、植物细胞2第2页，共136页，2023年，2月20日，星期日细胞工程植物细胞工程动物细胞工程植物组织培养植物体细胞杂交动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体胚胎移植核移植微生物细胞工程微生物细胞培养微生物细胞杂交3第3页，共136页，2023年，2月20日，星期日二、发展史1838～1839年提出细胞学说；

1902年提出细胞全能性；

细胞全能性：植物细胞具有原植物的全部遗传性，单细胞经人工培养，通过细胞分裂而恢复成完整植株。

1904年用胡萝卜胚培养成株，三十年代获愈伤组织。

1948年发现腺嘌呤，生长素对芽形成的影响，建立腺嘌呤/生长素的比例控制芽根分化。4第4页，共136页，2023年，2月20日，星期日二、发展史1956年发现激动素促芽形成效果高，促组培工作研究；

六十年代从曼陀萝花药培养获植株建花培技术；

1972年细胞融合成功；

1912年培养动物细胞；

1958年获细胞融合（种间、腹水癌细胞+病毒）

六十年代初换核术成功；

1975年获杂交瘤；

我国70年代中开始细胞融合；

现有40多种花粉植株，在我国首次成功。5第5页，共136页，2023年，2月20日，星期日三、细胞工程的基本操作无菌操作技术细胞培养技术细胞融合技术6第6页，共136页，2023年，2月20日，星期日1、无菌操作技术

细胞工程的所有实验都要求在无菌条件下进行，实验操作成在无菌室内进行。无菌室应定期用紫外线或化学试剂消毒，实验前后还应各消毒一次。无菌室外有间缓冲室，实验人员在此换鞋、更衣、戴帽，做好准备后方可进入无菌室，操作时实验者的双手应戴无菌手套。注意周围环境的卫生整洁。生物材料、一切器械、器皿和药品应进行灭菌或除菌。7第7页，共136页，2023年，2月20日，星期日

无菌操作杀菌和消毒物理法化学试剂抗生素超净工作台8第8页，共136页，2023年，2月20日，星期日2、细胞培养技术细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。虽然这些细胞培养在营养要求等方面有许多差异，但作为细胞培养，它们也有些共同之处。首先，要取材和除菌。除了淋巴细胞可直接抽取以外，植物材料在取材后，动物材料在取材前都要用一定的化学试剂进行严格的表面清洗、消毒。有时还需要某些特定的酶对材料进行顶处理，以期得到分散生长的细胞。其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基并进行灭菌。将生物材料接种于培养基中，最后将接种后的培养基放入培养室或培养箱中培养。当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。9第9页，共136页，2023年，2月20日，星期日10第10页，共136页，2023年，2月20日，星期日3、细胞融合技术两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。细胞融合是细胞工程的重要基本技术，其主要过程包括：①制备原生质体。由于微生物及植物细胞具坚硬的细胞壁，因此通常需用酶将细胞壁降解。动物细胞则无此障碍。②诱导细胞融合。两亲本细胞(原生质体)的悬浮液调至一定细胞密度；按1：1的比例混合后，用物理、化学或生物的方法促进融合。③筛选杂合细胞。将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让杂合细胞有选择地长出，其他未融合细胞无法生长。以获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。11第11页，共136页，2023年，2月20日，星期日细胞融合技术制备原生质体诱导细胞融合化学法物理法生物法筛选杂合细胞12第12页，共136页，2023年，2月20日，星期日

四、细胞培养技术

1、微生物细胞培养

2、植物细胞培养

3、动物细胞培养13第13页，共136页，2023年，2月20日，星期日

1、微生物细胞培养1）培养基的组成碳源氮源无机盐维生素水14第14页，共136页，2023年，2月20日，星期日1）培养基的组成碳源蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖或多糖类的可溶性淀粉、糊精及果胶；由其他谷物、马铃薯、红薯、木薯等得到的糖类物质。

作用：维持培养基的合适渗透压；

构造微生物体；

参与新陈代谢。

注意:不同浓度影响细胞的增殖分化。15第15页，共136页，2023年，2月20日，星期日1）培养基的组成氮源来源：无机氮源（氨气、铵盐或硝酸盐等）和有机氮源（氨基酸、蛋白质或尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等）。

作用：构成微生物细胞、蛋白质和核酸的主要元素。细胞生长分化需氮。

16第16页，共136页，2023年，2月20日，星期日1）培养基的组成

无机盐大量元素：每升培养基含0.5毫摩尔以上。

微量元素：每升培养基含0.5毫摩尔以下。

大量元素：P、K、Mg、S、Ca等；

微量元素：钴、铜、铁、锰、钼、锌等。

作用：构成菌体的组成；作为酶活性基团的组成部分；调节微生物体内的pH值。17第17页，共136页，2023年，2月20日，星期日1）培养基的组成维生素维生素是生物体生长不可缺少的一种或数种极微量的有机物质，但微生物在生长时，自身往往又缺乏合成这种有机物的能力，因此，必须由外界提供。与微生物关系较大的维生素，主要是B族维生素。作用：是微生物体内各种酶活性基团的组成部分。直接参与生物催化剂——酶的形成及蛋白质、脂肪的代谢。18第18页，共136页，2023年，2月20日，星期日1）培养基的组成维生素C（抗坏血酸）：强还原能力，防组

织氧化变褐。

B1（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤

组织活力有关。

B2（烟酸或维生素PP）：促代谢，促胚的

发育，高浓度会抑制生长。

B6（吡哆醇）：促根生长。

肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用，

但有助活性物质发挥作用。19第19页，共136页，2023年，2月20日，星期日1）培养基的组成水培养基大部分是水

来源：不含或少含某些离子的重蒸水（双蒸水）或去离子水。

目的：保持培养基成分完全人为控制。作用：起媒介作用

组成作物体（占75～80%）

提供O、H元素

运输物质、调节渗透压20第20页，共136页，2023年，2月20日，星期日2）培养基的种类按成分不同划分：

天然培养基：含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物。

合成培养基：由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。根据物理状态分：固体培养基半固体培养基液体培养基21第21页，共136页，2023年，2月20日，星期日2）培养基的种类按用途划分：基础培养基加富培养基（营养培养基）鉴别培养基选择培养基其他培养基：分析培养基、还原性培养基等22第22页，共136页，2023年，2月20日，星期日3）培养方法（1）固体培养；（2）液体培养；（3）连续培养；（4）中间补料培养；（5）同步培养；（6）混合培养。23第23页，共136页，2023年，2月20日，星期日2、植物细胞培养

广义的植物细胞培养是指在无菌条件下，将离体的单个游离细胞在人工控制的环境里培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术。食品工业意义上的植物细胞培养主要是指细胞悬浮培养，即使游离的植物细胞或一些小的细胞团在液体培养基中增殖并分离提取细胞产生的代谢产物。24第24页，共136页，2023年，2月20日，星期日2、植物细胞培养植物细胞体系建立的一般程序为：整体植株株——植物组织或器官——外植体——在固体培养基上诱发愈伤组织——愈伤组织继代培养——悬浮培养。25第25页，共136页，2023年，2月20日，星期日2、植物细胞培养基本操作过程：一般利用次亚氯酸盐的稀溶液、酒精、升汞等消毒剂对合适的植物材料进行表面消毒灭菌，在无面条件下切取未受损伤或未被污染的组织或器官(即外植体)，置于固体培养基上培养，随着细胞增殖形成不定型细胞团(即愈伤组织)，将此愈伤组织移入新鲜固体培养基中继代培养或转入液体培养基中悬浮培养。愈伤化时间随植物种类和培养基条件不同而不同，慢的需要几周以上，一旦增殖开始，就可反复继代培养，加速细胞生殖。继代培养可用试管或烧瓶等，大规模悬浮培养可用传统的搅拌罐、气式发酵罐。26第26页，共136页，2023年，2月20日，星期日2、植物细胞培养植物细胞培养与动物细胞培养相比，具最大的优点是植物细胞能在简单的合成培养基上生长。其培养基的成分由无机盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸和一些复合物质组成。包括植物生长所必需的16种营养元素和某些生理活性物质。27第27页，共136页，2023年，2月20日，星期日2、植物细胞培养

植物细胞培养方法单细胞培养、原生质体培养；固体培养、液体培养（摇瓶悬浮培养和大规模悬浮培养）。悬浮培养是指把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。28第28页，共136页，2023年，2月20日，星期日2、植物细胞培养植物细胞培养方法1）植物细胞悬浮培养法分批培养法半连续培养法连续培养法29第29页，共136页，2023年，2月20日，星期日2、植物细胞培养植物细胞培养方法2）植物细胞固定化培养技术

所谓固定化细胞培养，即把细胞固定在一种惰性基质，如琼脂、藻酸盐、聚丙烯酰胺、纤维或膜上面或里面，细胞不能运动，而营养液可以在细胞间流动，供应其营养。30第30页，共136页，2023年，2月20日，星期日常用的细胞固定化培养系统平床培养系统立柱培养系统31第31页，共136页，2023年，2月20日，星期日3、动物细胞培养动物细胞培养是指离散的动物活细胞体外人工无菌条件下的生长增殖，在整个过程中细胞不出现分化，不再形成组织。根据细胞是否贴附于支持物上生长的特性，培养的细胞可分为两大类：悬浮型和贴附型。悬浮型细胞是指生长时呈悬浮状态的细胞；贴附型是指贴附于支持物上生长的细胞。动物细胞培养的一般程序是：组织切碎-酶处理得单个细胞-培养-再扩大培养。32第32页，共136页，2023年，2月20日，星期日3、动物细胞培养1）细胞培养基的组成氨基酸维生素盐：钠、钾、镁、钙、氯等金属离子和酸根离子葡萄糖有机添加剂激素和生长因素33第33页，共136页，2023年，2月20日，星期日3、动物细胞培养2）常用培养基天然培养基合成培养基无血清培养基34第34页，共136页，2023年，2月20日，星期日3、动物细胞培养3）动物细胞培养方法悬浮培养贴壁培养固定化培养大规模培养法35第35页，共136页，2023年，2月20日，星期日五、细胞融合技术细胞融合技术是指在一定条件下，将两个或多个细胞融合在一个细胞的过程，细胞融合又称细胞杂交。36第36页，共136页，2023年，2月20日，星期日五、细胞融合技术1.细胞融合的方法

生物学法化学融合剂法电处理融合法37第37页，共136页，2023年，2月20日，星期日五、细胞融合技术2.微生物原生质体的制备与融合

1）微生物原生质体的制备为制备微生物的原生质体，必须有效地去除细胞壁，根据各种微生物细胞壁的不同结构和组成，可以用不同的方法来脱壁。目前，常用酶法来脱壁。38第38页，共136页，2023年，2月20日，星期日39第39页，共136页，2023年，2月20日，星期日五、细胞融合技术2.微生物原生质体的制备与融合

1）微生物原生质体的制备原生质体制备之前，微生物细胞需经过种子培养、振荡培养到一定的对数生长期，其菌量约为菌悬浮液中4×l08个／mL时为宜，然后加溶菌酶在42℃轻轻振荡45min即形成原生质体，由于原生质体对渗透压敏感，因此在琼脂培养基上涂布培养，原生质体会在低渗条件下破裂失活，不能形成菌落，曲落越少说明原生质体化效果愈好。原生质体形成率＝原生质休数/未经酶处理的总菌数。40第40页，共136页，2023年，2月20日，星期日五、细胞融合技术2.微生物原生质体的制备与融合

2）微生物原生质体融合和再生融合是把两亲本的原生质体混合在一起，采用不同的方法进行，最常用的是PEG融合和电融合。融合率＝融合子/两亲本原生质体再生菌落的总数41第41页，共136页，2023年，2月20日，星期日五、细胞融合技术3.植物原生质体的制备

1）取材与除菌

2）酶解

3）分离

4）洗涤

5）鉴定42第42页，共136页，2023年，2月20日，星期日五、细胞融合技术4.融合子的筛选

1）微生物融合子的筛选

2）植物融合子的鉴定

3）动物细胞融合子的鉴定43第43页，共136页，2023年，2月20日，星期日第二节植物细胞工程植物细胞工程：以植物细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为地精细操作，使细胞的一些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良品种或生产生物产品的目的的一种技术。44第44页，共136页，2023年，2月20日，星期日植物细胞工程通常采用的技术手段

植物组织培养植物体细胞杂交所采用技术的理论基础植物细胞的全能性45第45页，共136页，2023年，2月20日，星期日细胞的全能性：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。

生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。46第46页，共136页，2023年，2月20日，星期日脱分化：已分化（或成熟）的组织又恢复到无分化的初始状态。

在组织培养过程中，将已经分化的茎、叶、花等外植体进行培养，使其形成愈伤组织，回复到没有分化的状态。再分化：在组织培养过程中，对处于脱分化状态的愈伤组织进行培养，诱导其形成新的植物体的过程。47第47页，共136页，2023年，2月20日，星期日外植体：在植物组织培养过程中，从植物体上被分离下来接种到培养基上，供培养用的原生质体、细胞、组织、器官等。

建立外植体的过程：从植物组织（根尖、茎、芽、嫩叶、种子、花粉等）分离外植体→灭菌消毒→切取并将外植体接种于培养基上48第48页，共136页，2023年，2月20日，星期日愈伤组织：在培养基中，外植体切口处不断增殖产生的一团不定形的薄壁组织就是愈伤组织。

愈伤组织可使伤口愈合，保护表面细胞；植物扦插时，愈伤组织可形成不定根；植物嫁接时，愈伤组织可使接穗和砧木愈合；在植物组织培养中，愈伤组织可形成不定芽或不定根。49第49页，共136页，2023年，2月20日，星期日初代培养：在组织培养过程中，最初建立的外植体的无菌培养阶段。继代培养：在组织培养过程中，当外植体被接种一段时间后，将已经形成愈伤组织或已经分化出根、茎、叶、花等的培养物重新切割，转接到新的培养基上以进一步扩大培养的过程。试管苗：在无菌条件下的人工培养基上，对植物细胞、组织或器官进行培养所获得的再生植株。

50第50页，共136页，2023年，2月20日，星期日外植体愈伤组织新植株科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。一、植物组织培养51第51页，共136页，2023年，2月20日，星期日植物组织培养：通过无菌操作分离植物体的一部分作为外植体，接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括培养条件、激素、温度、光照、湿度等）进行培养，使其产生完整植株或者获得次生代谢产物的过程。外植体愈伤组织新植株52第52页，共136页，2023年，2月20日，星期日过程：初代培养和继代培养最终产品形式：试管苗或细胞代谢产物培养条件：光照、温度、相对湿度应用：试管苗的快速繁殖、无病毒植物的培育、提取次生代谢产物、人工种子的培育、转基因植物的生产等。53第53页，共136页，2023年，2月20日，星期日一、植物组织培养进行植物组织培养，一般要经历以下五个阶段：1外植体的选择及培养。2诱导去分化阶段。3继代增殖阶段。4诱导分化生根成芽阶段。5移栽成活阶段。54第54页，共136页，2023年，2月20日，星期日离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根芽植物体脱分化再分化脱分化由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。再分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。植物组织培养过程55第55页，共136页，2023年，2月20日，星期日离体植物细胞愈伤组织胚状体根芽植物体脱分化再分化

植物组织培养应用举例（一）56第56页，共136页，2023年，2月20日，星期日

紫草紫草素

愈伤组织

植物组织培养应用举例（二）57第57页，共136页，2023年，2月20日，星期日胚状体人工种皮人工胚乳

植物组织培养应用举例（三）人工种子58第58页，共136页，2023年，2月20日，星期日二、植物细胞培养

在离体条件下，将愈伤组织或者其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。59第59页，共136页，2023年，2月20日，星期日60第60页，共136页，2023年，2月20日，星期日三.植物细胞杂交（细胞融合）1960年英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体,开辟了原生质体融合研究的新阶段。植物细胞杂交的主要过程：1.原生质体的制备。2.原生质体的融合。3.杂合体的鉴别与筛选。61第61页，共136页，2023年，2月20日，星期日植物A细胞植物B细胞去壁原生质体A原生质体B原生质体融合融合体再生壁杂种细胞细胞分裂愈伤组织杂种植株去壁的常用方法：酶解法（纤维素酶、果胶酶等）

原生质体融合方法：物理法：离心、振动、电刺激等化学法：聚乙二醇（PEG）植物体细胞杂交

过程62第62页，共136页，2023年，2月20日，星期日(1)(1)(2)(3)(4)(5)

植物体细胞杂交过程示意图63第63页，共136页，2023年，2月20日，星期日白菜甘蓝白菜－甘蓝植物体细胞杂交应用64第64页，共136页，2023年，2月20日，星期日第三节动物细胞工程动物细胞工程是由多个学科综合组成的新兴技术。相关学科：基础生物学、生物化学、遗传学、免疫学、分子生物学、微生物学、化学工程学、应用物理、电子计算机等65第65页，共136页，2023年，2月20日，星期日动物细胞工程的应用：生产基因工程药物、单克隆抗体、疫苗等。主要特点：以工业化为目的，应用动物细胞培养的基本原理，研究生物活细胞为主体的生物反应过程，解决动物细胞培养过程中带有共性和特性的工程技术问题。66第66页，共136页，2023年，2月20日，星期日动物细胞工程通常采用的技术手段

动物细胞融合所采用技术的理论基础动物细胞培养单克隆抗体胚胎移植核移植细胞增殖全息胚学说67第67页，共136页，2023年，2月20日，星期日培养条件：适宜的温度、pH、溶解氧水平动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础68第68页，共136页，2023年，2月20日，星期日（1）原代培养：以动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织为材料，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，放入培养瓶中，在培养箱中培养。（2）传代培养：随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中培养。一、动物细胞培养69第69页，共136页，2023年，2月20日，星期日动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶10代细胞原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系单个细胞加培养液70第70页，共136页，2023年，2月20日，星期日动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液细胞株细胞系细胞增殖无限传代去掉组织间蛋白动物细胞培养不能最终培养成生物体71第71页，共136页，2023年，2月20日，星期日细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养细胞株细胞系注意界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系多数组织细胞固定在表面生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质改变72第72页，共136页，2023年，2月20日，星期日动物细胞动物细胞原代培养分裂10次细胞株传代培养分裂50次(细胞系)(细胞株)细胞系无限分裂遗传物质未发生改变遗传物质发生改变无限增殖73第73页，共136页，2023年，2月20日，星期日有关动物细胞培养的几个问题74第74页，共136页，2023年，2月20日，星期日（1）动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处：1、液体培养基2、成分中有动物血清等（动物体细胞大都生活在液体的环境）75第75页，共136页，2023年，2月20日，星期日

血清是一种很好的营养物质，含有动物体细胞生长所需要的营养物质，并给动物创造了生活环境。

任何血清使用前必须经过鉴定，只有无菌、无内毒素、无溶血或低溶血、蛋白质以及营养素达一定标准以上才能使用。

血清与血浆的主要区别是血清里不含纤维蛋白原。76第76页，共136页，2023年，2月20日，星期日（2）为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？

因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强。77第77页，共136页，2023年，2月20日，星期日（3）为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？

成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养（4）动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？

不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体78第78页，共136页，2023年，2月20日，星期日贴壁生长

大多数组织细胞不适应悬浮生长，必须在固定的表面生长和分裂。脱离下来

当表面相互接触时就停止分裂增殖——接触抑制

79第79页，共136页，2023年，2月20日，星期日动物细胞培养技术的应用（1）生产蛋白质生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。（3）用于检测有毒物质（4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据80第80页，共136页，2023年，2月20日，星期日培养结果获得细胞或细胞分泌蛋白培养目的动物血清液体培养基固体培养基培养基性质细胞的全能性原理动物细胞培养植物组织培养比较项目细胞株、细胞系植物体分泌蛋白快速繁殖、培育无病毒植株葡萄糖蔗糖植物激素培养基特有成分细胞的增殖植物组织培养和动物细胞培养的比较81第81页，共136页，2023年，2月20日，星期日二、动物细胞融合82第82页，共136页，2023年，2月20日，星期日细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒83第83页，共136页，2023年，2月20日，星期日用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核84第84页，共136页，2023年，2月20日，星期日动物细胞融合的意义（1）克服植物远缘杂交不亲和性。（2）扩大遗传重组范围、增加变异、创造新品种。（3）单克隆抗体的生产。85第85页，共136页，2023年，2月20日，星期日诱导动物细胞融合的方法物理法：离心、振动、电刺激化学法：聚乙二醇（PEG）生物法：灭活的动物病毒（丧失感染活性）86第86页，共136页，2023年，2月20日，星期日主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性细胞融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物、动物细胞融合的比较87第87页，共136页，2023年，2月20日，星期日动物细胞融合最重要的用途制备单克隆抗体88第88页，共136页，2023年，2月20日，星期日抗原吞噬细胞T细胞B细胞增殖、分化效应B细胞T记忆细胞B记忆细胞抗体抗原杀灭结合增殖增殖、分化效应T细胞靶细胞接触、激活溶酶体酶靶细胞解体死亡增殖淋巴因子增强免疫细胞作用再次进入89第89页，共136页，2023年，2月20日，星期日长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。用单个B细胞进行克隆，得到的细胞群能够分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体，这种抗体叫做单克隆抗体。90第90页，共136页，2023年，2月20日，星期日（1）提出问题：从动物血清中分离抗体的方法产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏单克隆抗体

（2）设计方案：由于每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，利用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，就可以产生单克隆抗体。

由于B淋巴细胞不能无限增殖，因此利用小鼠骨髓瘤细胞与之融合，就可达到目的。91第91页，共136页，2023年，2月20日，星期日

单克隆抗体制备过程：

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体（选择性培养基）选择性培养基：使亲本细胞不能存活而杂种细胞可存活92第92页，共136页，2023年，2月20日，星期日本过程利用了免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。

93第93页，共136页，2023年，2月20日，星期日细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活有无限增殖能力（失去凋亡机制，失去接触抑制等）的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞。94第94页，共136页，2023年，2月20日，星期日单克隆抗体的应用①在基础理论研究中具有重要意义②在疾病诊断、治疗和预防方面，具有特异性高、灵敏度高等优越性。③生物导弹（作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤）95第95页，共136页，2023年，2月20日，星期日

目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。资料96第96页，共136页，2023年，2月20日，星期日小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势97第97页，共136页，2023年，2月20日，星期日三、细胞核移植技术细胞核移植，就是将一个细胞核用显微注射的方法放进另一个细胞里去。供体——胚胎的干细胞核；体细胞的核受体——多是动物的卵子用途——细胞核移植技术只要用于研究胚胎发育过程中细胞核和细胞质的功能，以及二者的关系；探讨有关遗传、发育和细胞分化等方面的基本理论问题。98第98页，共136页，2023年，2月20日，星期日多莉羊的培育过程细胞核移植卵细胞C母绵羊子宫Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵细胞细胞拆合技术妊娠99第99页，共136页，2023年，2月20日，星期日黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多莉100第100页，共136页，2023年，2月20日，星期日

采用此方法可以将两个不同种、属的动物优点集中在一起，产生具有双亲优点的可繁殖的杂种动物。

细胞核移植对动物优良杂交种的无性繁殖具有重大意义。这一技术的成功与完善对于优良家禽的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种意义重大。101第101页，共136页，2023年，2月20日，星期日克隆动物的研究意义1.用于生物学和医学研究的实验动物2.改良动物品种3.治疗人类疾病4.保护濒危动物102第102页，共136页，2023年，2月20日，星期日四、动物的胚胎移植

解决某些妊娠时间长、每胎产子数量少的优良种畜的繁殖速度问题。103第103页，共136页，2023年，2月20日，星期日（1）激素促多排卵（2）体外受精（3）培育胚胎（4）胚胎激素处理（5）胚胎植入母体操作过程104第104页，共136页，2023年，2月20日，星期日胚胎移植技术试管动物（婴儿）培养过程：卵细胞精子体外受精受精卵胚胎新个体母体子宫内孕育、产出105第105页，共136页，2023年，2月20日，星期日①植物组织培养是植物细胞工程技术的基础。②动物细胞培养是各种动物细胞工程技术的基础。③为达到特定的目的，许多细胞工程技术往往需要同时运用。不同细胞工程技术间的关系106第106页，共136页，2023年，2月20日，星期日第四节微生物细胞工程微生物细胞工程：应用微生物细胞进行细胞水平的研究和生产，具体内容包括各种微生物细胞的培养、遗传性状的改变、微生物细胞的直接利用或获得细胞代谢产物等。107第107页，共136页，2023年，2月20日，星期日一、微生物原生质体融合用水解酶除去微生物细胞壁，获得原生质体，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体形成一个细胞，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子，这个过程就称为微生物原生质体融合。108第108页，共136页，2023年，2月20日，星期日微生物原生质体融合原核细胞的原生质体融合真菌的原生质体融合109第109页，共136页，2023年，2月20日，星期日（一）微生物原生质体融合的优势（1）大幅度提高亲本之间的重组频率细胞壁是微生物细胞之间物质、能量和信息交流的主要屏障，同时也阻碍了细胞遗传物质的交换和重组，而原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交换的主要障碍。融合过程中促融合剂的诱导作用，重组频率显著提高。110第110页，共136页，2023年，2月20日，星期日（一）微生物原生质体融合的优势（2）扩大重组的亲本范围常规杂交的亲本间必须有感受态，而有的菌株由于其表面结构缘故而无法用常规杂交方法实现重组。原生质体由于完全或部分失去了细胞壁，因此可以实现种间、属间甚至门间的远缘杂交。111第111页，共136页，2023年，2月20日，星期日（一）微生物原生质体融合的优势（3）遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状的机会更大原生质体融合时亲本整套染色体参与交换。原生质体融合时还同时传递了细胞质。除进行双亲融合外，还能进行多亲融合。112第112页，共136页，2023年，2月20日，星期日（二）微生物原生质体融合的基本步骤（1）亲本及遗传标记的选择原生质体亲本的选择应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的杂种优势。遗传标记：应带有遗传标记，便于重组体的检出。应根据不同的实验目的，选择遗传标记。营养缺陷和抗性标记用于遗传分析；热致死（50℃2h或60℃5min）用于大规模生产育种；孢子颜色是新技术，荧光染色；菌落形态。113第113页，共136页，2023年，2月20日，星期日（2）原生质体制备酶法分离原生质体的影响因素培养基组成菌体培养方式菌体菌龄稳定剂酶解前的预处理酶系和酶的浓度酶的作用温度和pH菌体密度酶解方式114第114页，共136页，2023年，2月20日，星期日（3）原生质体再生

定义:

原生质体在稳定的再生培养基上，重新形成细胞壁，恢复至完整细胞形态，进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生质体再生。115第115页，共136页，2023年，2月20日，星期日（3）原生质体再生

定义:

原生质体在稳定的再生培养基上，重新形成细胞壁，恢复至完整细胞形态，进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生质体再生。116第116页，共136页，2023年，2月20日，星期日影响再生的因素①菌体生理状态年轻细胞比年老的细胞容易再生，菌丝顶端比老菌丝容易再生。②稳定剂高渗溶液③酶浓度和作用时间酶浓度及作用时间过大或者时间过长，原生质体脱水皱缩，影响原生质体活性117第117页，共136页，2023年，2月20日，星期日④再生培养基组成碳源，稳定剂、细胞壁提取物都会影响再生率⑤残存菌体的分离残存菌体必须分离除去⑥原生质体密度密度不能过大，否则先长出的菌落抑制后生长的菌落。⑦再生培养基上的冷凝水影响渗透压，平板干燥⑧再生方法不宜涂布，双层平板法118第118页，共136页，2023年，2月20日，星期日（4）诱导融合和再生利用营养缺陷型标记选择融合体利用抗药性选择融合体用灭活原生质体检出融合体利用荧光染色法选择融合体双亲对碳源的利用不同检出融合体（5）融合体检出和分离119第119页，共136页，2023年，2月20日，星期日（三）微生物原生质体融合的应用（1）提高产量或质量，合成新物质诺卡氏菌（2）改良菌种的遗传特性苏云金杆菌以色列变种与库斯塔基变种酿酒酵母，粉状酵母和凝集性酵母（3）优化菌种发酵特性获得耐热性能更好的发酵菌株120第120页，共136页，2023年，2月20日，星期日（三）微生物原生质体融合的应用（4）质粒转移种内、种间及远缘融合，为质粒转移提供了新的途径（5）原生质体与细胞核融合为育种提供新模式（6）进行遗传分析原生质体融合不受亲缘关系的影响，不需要详细了解亲本的遗传背景，便于遗传操作。121第121页，共136页，2023年，2月20日，星期日二、原核细胞的原生质体融合革兰氏阳性菌：溶菌酶溶解其细胞壁。溶菌酶能特异性地切开肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁溶解。革兰氏阴性菌：除了溶菌酶外，还要添加适量的EDTA（乙二胺四乙酸），除去细胞壁。122第122页，共136页，2023年，2月20日，星期日

革兰氏阳性菌细胞融合的过程（1）分别培养带遗传标志的双亲本菌株至对数生长中期，此时细胞壁最易被降解；（2）分别离心收集菌体，以高渗培养基制成菌悬液，以防止下阶段原生质体破裂；（3）混合双亲本，加入适量溶菌酶，作用20～30min；（4）离心后得原生质体，用少量高渗培养基制成菌悬液；（5）加入10倍体积的聚乙二醇（40%）促使原生质体凝集、融合；（6）数分钟后，加入适量高渗培养基稀释；（7）涂接于选择培养基上进行筛选。长出的菌落很可能已结合双方的遗传因子，要经数代筛选及鉴定才能确认已获得杂合菌株。123第123页，共136页，2023年，2月20日，星期日

革兰氏阴性菌细胞融合的过程在加入溶菌酶数分钟后，应添加0.1mol/L的EDTANa2共同作用15～20min，则可使90%以上的革兰氏阴性菌转变为可供细胞融合用的球状体。124第124页，共136页，2023年，2月20日，星期日三、真菌的原生质体融合真菌主要有单细胞的酵母类和多细胞菌丝真菌类，降解它们的细胞壁、制备原生质体是细胞融合的关键。真菌的细胞壁成分比较复杂：几丁质和各类葡聚糖构成纤维网状结构，其中夹杂少量的甘露糖、蛋白质和脂类。可在含有渗透压稳定剂的反应介质中加入消解酶进行酶解；也可用取自蜗牛消化道的蜗牛酶进行处理。其他酶：纤维素酶、几丁质酶、新酶等。125第125页，共136页，2023年，2月20日，星期日二、真菌的原生质体融合原生质体的融合：与前述细胞融合相似，以PEG（聚乙二醇）为融合剂，在特异的选择培养基上筛选融合。真菌一般都是单倍体，融合后，只有那些形成真正单倍重组题的融合子才能稳定传代。具有杂合双倍体和异核体的融合子遗传特性不稳定，尚需经多代考证才能最后断定是否为真正的杂合细胞。126第126页，共136页，2023年，2月20日，星期日第五节细胞工程的应用细胞工程作为科学研究的一种手段，已经渗入到生物工程的各个方面，成为必不可少的配套技术。在农林、园艺和医学等领域中，细胞工程正在为人类做出巨大的贡献。127第127页，共136页，2023年，2月20日，星期日1.粮食与蔬菜生产利用细胞工程技术进行作物育种，是迄今人类受益最多的一个方面。我国在这一领域已达到世界先进水平，以花药单倍体育种途径，培育出的水稻品种或品系有近百个，小麦有30个左右。其中河南省农科院培育的小麦新品种，具有抗倒伏、抗锈病、抗白粉病等优良性状。128第128页，共136页，2023年，2月20日，星期日1.粮食与蔬菜生产在常规的杂交育种中，育成一个新品种