生物化学第二章核酸的结构

生物化学第二章核酸的结构第1页，共165页，2023年，2月20日，星期一第2页，共165页，2023年，2月20日，星期一第3页，共165页，2023年，2月20日，星期一第4页，共165页，2023年，2月20日，星期一概述核酸(nucleicacid)

以核苷酸为单位组成的生物大分子携带和传递遗传信息第5页，共165页，2023年，2月20日，星期一核酸的研究历史和重要性1869年

Miescher从脓细胞的细胞核中分离出核素（nuclein），后称核酸（nucleicacid）；1944

Avery等成功进行肺炎球菌转化试验；第6页，共165页，2023年，2月20日，星期一第7页，共165页，2023年，2月20日，星期一第8页，共165页，2023年，2月20日，星期一1952年Hershey等的实验：

32P-DNA，35S-蛋白质(外壳)，再用标记的噬菌体去感染培养的大肠杆菌，证明DNA是遗传物质。第9页，共165页，2023年，2月20日，星期一第10页，共165页，2023年，2月20日，星期一第11页，共165页，2023年，2月20日，星期一蛋白质(外壳)第12页，共165页，2023年，2月20日，星期一1953Watson和Crick建立了DNA结构的双螺旋模型，说明了基因的结构、信息和功能三者间的关系，推动了分子生物学的迅猛发展。第13页，共165页，2023年，2月20日，星期一WatsonandCrick19531990s第14页，共165页，2023年，2月20日，星期一

1958

Crick提出遗传信息传递的中心法则。

DNARNA蛋白质转录翻译逆转录第15页，共165页，2023年，2月20日，星期一

70年代建立DNA重组技术，改变了分子生物学的面貌，并导致生物技术的兴起。

80年代

RNA研究出现第二次高潮：ribozyme、反义RNA、“RNA世界”假说等等。90年代以后

实施人类基因组计划（HGP）,开辟了生命科学新纪元。生命科学进入后基因时代：功能基因组学（functionalgenomics）蛋白质组学（proteomics）结构基因组学（structuralgenomics）RNA组学（Rnomics）或核糖核酸组学（ribonomics）60年代

RNA研究取得大发展（操纵子学说，遗传密码，逆转录酶）。第16页，共165页，2023年，2月20日，星期一核酸的种类、分布种类

脱氧核糖核酸（DNA）：主要的遗传物质。核糖核酸（RNA）

tRNA

(15%)

mRNA

(3-5%)

rRNA

(80%)

其它RNA：如反义RNA等第17页，共165页，2023年，2月20日，星期一分布DNA原核生物真核生物拟核质粒染色体（质）细胞器：如线粒体、叶绿体等RNA：核内（snRNA、hnRNA

）、胞质(scRNA)、细胞器

病毒第18页，共165页，2023年，2月20日，星期一第一节核酸的化学组成及其一级结构TheChemicalComponentandPrimaryStructureofNucleicAcid第19页，共165页，2023年，2月20日，星期一一、元素组成有C、H、O、N、P等一般不含元素SP元素的含量较多并且恒定，约占9～11%第20页，共165页，2023年，2月20日，星期一

二、核苷酸酸第21页，共165页，2023年，2月20日，星期一A鸟嘌呤GCTU（一）碱基1.种类：第22页，共165页，2023年，2月20日，星期一稀有碱基种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。第23页，共165页，2023年，2月20日，星期一1）碱性

嘌呤碱基和嘧啶碱基都具有弱碱性。环内氨基的pKa值约为9.5。碱性主要是环内氨基的贡献。碱基环外的氨基（存在于A、G和C）的碱性很弱，在生理pH条件下不能被质子化。2.碱基的性质：第24页，共165页，2023年，2月20日，星期一2）互变：酮式烯醇式氨基亚氨基第25页，共165页，2023年，2月20日，星期一3）紫外吸收：260nm220240260280300320nm481216胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶腺嘌呤鸟嘌呤消光系数波长Ε×10-3第26页，共165页，2023年，2月20日，星期一4）光聚合反应

在DNA分子中，两个相邻胸腺嘧啶碱基，在紫外光照射下，可发生聚合反应，破坏了正常复制或转录。

第27页，共165页，2023年，2月20日，星期一5）碱基环的亲电取代反应6）碱基环的亲核加成反应7）碱基环氮原子的烷基化反应

8）环外氨基的反应

9）环外氧的烷基化反应第28页，共165页，2023年，2月20日，星期一（二）戊糖第29页，共165页，2023年，2月20日，星期一第30页，共165页，2023年，2月20日，星期一（四）核苷酸1.核苷(ribonucleoside)碱基和核糖（脱氧核糖）糖苷键N-9N-1C-1'（三）磷酸：第31页，共165页，2023年，2月20日，星期一NNNNOOHOHNH2HOCH2NNNH2OHOHOHOCH29111第32页，共165页，2023年，2月20日，星期一核苷：腺苷，鸟苷脱氧核苷：第33页，共165页，2023年，2月20日，星期一几种稀有核苷假尿苷（）二氢尿嘧啶（DHU）AmCH3CH3H3Cm26GHH5HH第34页，共165页，2023年，2月20日，星期一2.核苷酸(ribonucleotide)核苷（脱氧核苷）磷酸磷酸酯键5C第35页，共165页，2023年，2月20日，星期一腺嘌呤核苷酸（AMP）Adenosinemonophosphate脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）Deoxyadenosinemonophosphate鸟嘌呤核苷酸（GMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP）脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP)HOH第36页，共165页，2023年，2月20日，星期一多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTPATPADPAMP第37页，共165页，2023年，2月20日，星期一第38页，共165页，2023年，2月20日，星期一第39页，共165页，2023年，2月20日，星期一第40页，共165页，2023年，2月20日，星期一环化核苷酸:cAMP，cGMPcAMP第41页，共165页，2023年，2月20日，星期一含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD等都含有AMP第42页，共165页，2023年，2月20日，星期一肌苷酸及鸟苷酸(强力味精)IMP

GMP第43页，共165页，2023年，2月20日，星期一两类核酸的基本成分第44页，共165页，2023年，2月20日，星期一核苷酸的连接

以3'，5'–磷酸二酯键连接三、核酸的一级结构定义:核酸中核苷酸的排列顺序，也称为碱基序列。第45页，共165页，2023年，2月20日，星期一第46页，共165页，2023年，2月20日，星期一5´端3´端CGA第47页，共165页，2023年，2月20日，星期一多聚核苷酸的表示方式5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′

或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′

ACGTGCGTACGUAUGUDNA

RNAT5′3′OHU5′3′OHOHOHOHOH方向：？第48页，共165页，2023年，2月20日，星期一核酸分子的大小：寡核苷酸(oligonucleotide)<50多核苷酸（polynucleotide）>50第49页，共165页，2023年，2月20日，星期一第二节DNA的空间结构与功能DimensionalStructureandFunctionofDNA第50页，共165页，2023年，2月20日，星期一一、DNA的二级结构——双螺旋结构第51页，共165页，2023年，2月20日，星期一（一）DNA双螺旋结构的研究背景

20年代，Levene研究了核酸的化学结构并提出四核苷酸假说；40年代末，Avery,Hershey和Chase的实验严密地证实了DNA就是遗传物质；50年代初，Chargaff应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术，对多种生物DNA作碱基定量分析，发现DNA碱基组成有如下规律：

第52页，共165页，2023年，2月20日，星期一不同生物来源的DNA四种碱基比例关系DNA来源腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）（A+T）/（G+C）大肠杆菌25.424.824.125.71.01小麦27.327.122.822.71.21鼠28.628.421.421.51.33猪：肝29.429.720.520.51.43胸腺30.028.920.420.7脾29.629.220.420.8酵母31.332.918.717.51.079第53页，共165页，2023年，2月20日，星期一(1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同(2)同一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变；(3)几乎所有的DNA：(A)=［T］，

(G)=［C］(4)不同生物来源的DNA碱基组成不同。第54页，共165页，2023年，2月20日，星期一Wilkins和Franklin的高质量的X-衍射图第55页，共165页，2023年，2月20日，星期一Watson,Crick

（1953）在Chargaff法则及Wilkins,Franklin的X线衍射工作基础上提出DNA的双螺旋（doublehelix）结构模型。

第56页，共165页，2023年，2月20日，星期一2.0nm小沟大沟第57页，共165页，2023年，2月20日，星期一第58页，共165页，2023年，2月20日，星期一DNA双螺旋结构模型要点：1.右手反平行双螺旋；２.表面有大沟及小沟。螺旋一周包含10对碱基，螺距为3.4nm，直径为2nm；３.磷酸和脱氧核糖骨架位于螺旋外侧，碱基位于内侧。４.两条链间存在碱基互补规律：

A与T或G与C配对５.螺旋的稳定因素为氢键和碱基堆砌力。

第59页，共165页，2023年，2月20日，星期一逆向平行双螺旋；内有碱基配氢键；平行碱基堆积力；三个数字记心间。记忆：第60页，共165页，2023年，2月20日，星期一第一张DNA的照片（扫描隧道电镜）第61页，共165页，2023年，2月20日，星期一DNA的双螺旋结构的意义揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征确认了碱基配对原则是遗传信息传递和表达的分子基础。第62页，共165页，2023年，2月20日，星期一DNA的种类A-DNA；B-DNA；B′-DNA；C-DNA；D-DNA；Z-DNA；（三）DNA双螺旋结构的多样性（多态性）拓宽了人们的视野第63页，共165页，2023年，2月20日，星期一第64页，共165页，2023年，2月20日，星期一第65页，共165页，2023年，2月20日，星期一第66页，共165页，2023年，2月20日，星期一第67页，共165页，2023年，2月20日，星期一

真核生物染色体DNA是线型双链DNA。

细胞器DNA、原核生物的染色体DNA、质粒DNA都是环状双链第68页，共165页，2023年，2月20日，星期一补充知识：又称H-DNA结构：大沟中容纳第三条链形成三股螺旋。三碱基体:T-A-T，C-G-C。作用：还不清楚。(一)三链DNA（triplehelixDNA）第69页，共165页，2023年，2月20日，星期一DNA分子内的三链结构多聚嘌呤多聚嘧啶DNA三链间的碱基配对T-A-TC-G-C第70页，共165页，2023年，2月20日，星期一(二)DNA不均一性1.DNA结构的不均一性：

DNA分子中的四种碱基A，T，C，G非均匀分布。2.主要形式：

1）反向重复序列

2）富含A/T的序列第71页，共165页，2023年，2月20日，星期一反向重复序列(invertedrepeats)：又称回文序列通常是作为一种特别信号富含A/T的序列：调节功能的DNA区段第72页，共165页，2023年，2月20日，星期一第73页，共165页，2023年，2月20日，星期一(三)嘌呤和嘧啶的排列顺序实验发现：5′GC3′与5′CG3′对双螺旋结构稳定性的影响很大，前者的稳定性远大于后者。第74页，共165页，2023年，2月20日，星期一二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装超螺旋结构(superhelix或supercoil)：

正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反第75页，共165页，2023年，2月20日，星期一螺旋和超螺旋电话线螺旋超螺旋第76页，共165页，2023年，2月20日，星期一超螺旋的定量描叙White方程：L=T+WL（Linkingnnmber）：DNA中一条链绕另一条链的总次数。其特点是:(1)L是整数；(3)右手螺旋对L取正值。第77页，共165页，2023年，2月20日，星期一W（Writhingnumber）：超数旋数。其特点是：(1)可以是非整数；(2)是变量；(3)右手螺旋时，W取负值。第78页，共165页，2023年，2月20日，星期一T（Twistingnumber）：双螺旋的圈数。其特点是：(1)可以是非整数；(2)是变量；(3)右手螺旋时T为正值。超螺旋密度λ来表示：λ=（L-T）/T在天然DNA中，λ约为-0.05第79页，共165页，2023年，2月20日，星期一DNA超螺旋结构形成的意义:

使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中；推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。第80页，共165页，2023年，2月20日，星期一（一）原核生物DNA的高级结构在共价闭环双螺旋基础上进一步扭转盘曲,形成超螺旋(supercoil)体积进一步压缩。

原核双链环状DNA（dcDNA）病毒单链环状DNA（scDNA）单链线性DNA（ssDNA）

第81页，共165页，2023年，2月20日，星期一第82页，共165页，2023年，2月20日，星期一细菌拟核（nucleoid）的突环结构RNA-蛋白质核心突环由双链DNA结合碱性蛋白质组成平均一个突环含有约40kpDNA第83页，共165页，2023年，2月20日，星期一第84页，共165页，2023年，2月20日，星期一噬菌体T2结构头部颈圈尾部基板尾丝尖钉第85页，共165页，2023年，2月20日，星期一动物病毒切面模式图被膜（脂蛋白、碳水化合物）衣壳（蛋白质）核酸突起（糖蛋白）病毒粒第86页，共165页，2023年，2月20日，星期一人基因组DNA3106kbp。平均长度为？怎样存在于平均直径为5μm的细胞核中?1.经多级折叠形成1.4μm直径，长度小于5μm的染色体。2.染色体的基本结构——

核小体（二）真核生物DNA的空间结构第87页，共165页，2023年，2月20日，星期一第88页，共165页，2023年，2月20日，星期一核小体的组成：DNA：约200bp组蛋白：H1H2A、H2BH3H4核小体(nucleosome)：

染色质的基本组成单位，由DNA和组蛋白共同构成。第89页，共165页，2023年，2月20日，星期一八聚体:H2A,H2B,H3,H4各两分子双螺旋DNA:绕其旋转1.75圈,约含140bp核心颗粒第90页，共165页，2023年，2月20日，星期一H2BH2AH3H4a2a3a1a2a3a1a2a3a1a2a3a19L1L2aN第三章核酸第91页，共165页，2023年，2月20日，星期一H3H4第92页，共165页，2023年，2月20日，星期一4helix-bundleH3H4H3’H4’第93页，共165页，2023年，2月20日，星期一4helix-bundleH4H2BH2A第94页，共165页，2023年，2月20日，星期一H4H2BH2AH3第95页，共165页，2023年，2月20日，星期一H4H2BH2AH3Diameter=110

Aº13第96页，共165页，2023年，2月20日，星期一H4H2BH2AH3Width=45Aº14第97页，共165页，2023年，2月20日，星期一第98页，共165页，2023年，2月20日，星期一DNA（2nm）核小体链（11nm）纤丝（30nm，每圈6个核小体）突环（150nm，每个突环大约75000bp）玫瑰花结（300nm，6个突环）螺旋圈（700nm，每圈30个玫瑰花）染色体（1400nm，每个染色体含10个玫瑰花200bp）染色体四级组装.mov第99页，共165页，2023年，2月20日，星期一第100页，共165页，2023年，2月20日，星期一第101页，共165页，2023年，2月20日，星期一三、DNA的功能1.基因（gene）：一段有功能的DNA片段，DNA分子的最小功能单位（交换单位）。携带遗传信息2.基因组（genome）：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。病毒SV405.1×103bp大肠杆菌5.7×106bp人3×109bp第102页，共165页，2023年，2月20日，星期一第三节

RNA的结构与功能StructureandFunctionofRNA第103页，共165页，2023年，2月20日，星期一RNA的种类、分布、功能第104页，共165页，2023年，2月20日，星期一细胞RNA通常都是线型单链病毒RNA有线型与环状、双链与单链第105页，共165页，2023年，2月20日，星期一种类繁多；分子量较小;单股链存在，可有局部二级结构；含有尿嘧啶(uridin,U)而不含胸腺嘧啶稀有碱基较多；tRNA还具有明确的三级结构；RNA的特点（与DNA相比）：第106页，共165页，2023年，2月20日，星期一一、信使RNA(messengerRNA)的结构与功能特点：占细胞中总ＲＮＡ的１％－５％不均一分子有编码序列与非编码序列代谢活跃第107页，共165页，2023年，2月20日，星期一

1.原核生物mRNA的结构特点（1）５′端：翻译起始序列３′端：翻译终止序列（2）信息区：多个基因串联（多顺反子）少量的间隔序列5´3´顺反子A顺反子B顺反子C插入顺序插入顺序先导区末端顺序第108页，共165页，2023年，2月20日，星期一

a.５´端：帽子b.３´端：尾结构c.信息区：一个基因信息（单顺反子）2.真核生物mRNA的结构特点AAAAAAA-OH5´

“帽子”PolyA3´

顺反子Am7G-5´ppp第109页，共165页，2023年，2月20日，星期一（1）核内不均一ＲＮＡ（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA）

真核生物ＤＮＡ转录生成mRNA时的初级转录物即成熟mRNA的前体。第110页，共165页，2023年，2月20日，星期一（2）帽子结构：NN+NNOOCH3CH2OPOPOPOCH2BOOOPHOOCH2HOOOBOOOOOO55m7GpppNm第111页，共165页，2023年，2月20日，星期一（3）３´端尾结构

20-250个多聚腺苷酸（polyA）

AAAA……An参与mRNA核内向胞质的转移维系mRNA的稳定性翻译起始的调控（4）帽子结构和多聚A尾的功能第112页，共165页，2023年，2月20日，星期一3.mRNA的功能：传送遗传信息DNAmRNA蛋白转录翻译细胞质细胞核DNA内含子外显子转录转录后剪接转运mRNAhnRNA翻译蛋白第113页，共165页，2023年，2月20日，星期一1.tRNA的一级结构特点：含10%~20%稀有碱基

3´末端为—CCA-OH5´末端大多数为pG二、转运RNA的结构与功能研究最多的是tRNA。tRNA.swf第114页，共165页，2023年，2月20日，星期一2.tRNA的二级结构：三叶草型，四环五臂

（1）氨基酸臂：CCA-OH结构，携带氨基酸（2）二氢尿嘧啶臂：DHU环（3）反密码臂：反密码子（4）额外臂：可变环，tRNA分类的标志（5）TψC环臂：含稀有碱基TψC第115页，共165页，2023年，2月20日，星期一第116页，共165页，2023年，2月20日，星期一3.tRNA的三级结构---倒L型一端：CCA-OH一端：反密码环拐角：TψC与5sRNA作用第117页，共165页，2023年，2月20日，星期一三、rRNA的结构１.特点：①rRNA占细胞内总RNA的60%②成熟rRNA为单链局部双螺旋

③用沉降系数（S）表示大小第118页，共165页，2023年，2月20日，星期一18SrRNA第119页，共165页，2023年，2月20日，星期一2.rRNA的种类（根据沉降系数）真核生物5SrRNA5.8SrRNA28SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNA第120页，共165页，2023年，2月20日，星期一70S80S50S30S60S40S31proteins23SRNA5SRNA21proteins16SRNA49proteins28SRNA5.8SRNA33proteins18SRNA第121页，共165页，2023年，2月20日，星期一3.保守序列：（1）16SrRNA的3´-端序列ACCUCCU，是mRNA的识别位点。（2）原核生物5srRNA/真核生物5.8srRNA的第43-47位的CGAAC识别tRNA中TΨC环。第122页，共165页，2023年，2月20日，星期一四、其他小分子RNA及RNA组学非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)1.snmRNAs的种类：核内小RNA、核仁小RNA、胞质小RNA催化性小RNA、小片段干涉RNA

2.snmRNAs的功能：参与hnRNA和rRNA的加工和转运。第123页，共165页，2023年，2月20日，星期一研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。

3.RNA组学第124页，共165页，2023年，2月20日，星期一核酸的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid第四节第125页，共165页，2023年，2月20日，星期一一、物理性质1.性状：RNA呈白色的粉末或结晶；

DNA则为疏松的纤维状固体。2.溶解性：不溶有机溶剂，其钠盐易溶于水。在0.14mol/L的NaCl溶液中DNA蛋白溶解度最低，RNA蛋白溶解度较大。3.粘性：DNA大于RNA。DNA粘度与分子形状有关：

线形分子>不规则线团分子>球形分子第126页，共165页，2023年，2月20日，星期一（1)DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸(2)判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.04.紫外吸收：260nm；2202402602800.10.20.30.4波长（nm）光吸收123第127页，共165页，2023年，2月20日，星期一二、化学性质：1.较强的酸性；2.核酸的两性解离性及等电点由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。DNA的等电点为4～4.5RNA的等电点为2～2.5

第128页，共165页，2023年，2月20日，星期一3．核酸的水解（1）酸或碱水解

在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，DNA在同样条件下则不受影响。（2）酶水解DNA水解酶（DNases）RNA水解酶（RNases）核酸外切酶和核酸内切酶第129页，共165页，2023年，2月20日，星期一二、DNA的变性(denaturation)1.定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程，一级结构仍保持完好。加热部分双螺旋解开无规则线团链内碱基配对第130页，共165页，2023年，2月20日，星期一2.变性后其它理化性质变化：OD260增高 粘度下降生物活性丧失浮力密度升高 比旋度下降第131页，共165页，2023年，2月20日，星期一3.热变性解链曲线：Tm第132页，共165页，2023年，2月20日，星期一影响Tm值大小因素：（1）与分子中的G+C比例相关图Tm=69.3+0.41(G+C)%；Tm=4(G+C)+2(A+T)（2）与核酸分子的长度相关（3）核酸纯度、溶液离子强度、酸碱度等溶液的离子强度较低时，Tm值较低，DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。图第133页，共165页，2023年，2月20日，星期一第134页，共165页，2023年，2月20日，星期一第135页，共165页，2023年，2月20日，星期一三、DNA的复性与分子杂交DNA复性(renaturation)在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。第136页，共165页，2023年，2月20日，星期一退火(annealing)

热变性的DNA经缓慢冷却后复性。低色效应（hypochromiceffect）减色效应第137页，共165页，2023年，2月20日，星期一2.影响DNA复性的因素（1）温度和时间：（2）DNA复杂程度/浓度（3）阳离子浓度第138页，共165页，2023年，2月20日，星期一

3.DNA的变性和复性原理的应用：核酸杂交与探针技术聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)第139页，共165页，2023年，2月20日，星期一不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些不同来源的核苷酸单链由于存在局部碱基互补片段，而在复性时形成杂化双链（heteroduplex），此过程称分子杂交。（1）核酸分子杂交(hybridization)

第140页，共165页，2023年，2月20日，星期一（2）核酸分子杂交的应用1）研究DNA分子中某一种基因的位置2）定两种核酸分子间的序列相似性3）检测某些专一序列在待检样品中存在与否4）是基因芯片技术的基础第141页，共165页，2023年，2月20日，星期一第142页，共165页，2023年，2月20日，星期一探针(Probe)定义：是标记有放射性同位素如32P、35S或生物素标记的一小段核苷酸单链，称为探针。十数个至数百个。应用：疾病的诊断。加热退火第143页，共165页，2023年，2月20日，星期一Southern印迹法DNA分子片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜与放射性标记DNA探针杂交放射自显影凝胶滤膜第144页，共165页，2023年，2月20日，星期一补充：核酸的分离纯化、测定一、

分离核酸的一般原则1.两个原则：①保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。2.要求①

样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。第145页，共165页，2023年，2月20日，星期一3.注意事项①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；②减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行；③防止核酸的生物降解。④

减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。

第146页，共165页，2023年，2月20日，星期一二、核酸分离纯化的一般步骤破碎细胞→去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子→→沉淀核酸→去除盐类、有机溶剂等杂质→纯化干燥→溶解。第147页，共165页，2023年，2月20日，星期一三、核酸的测定方法1.紫外吸收法即可由下式计算样品中的核酸含量：C=Mr×A260/ε×L其中：C为核酸的含量（mg/mL），Mr为相对分子质量，A260为核酸溶液的吸光度，ε为摩尔消光系数（即1升溶液中含1摩尔核酸的光吸收值，L为比色杯的内径（cm）第148页，共165页，2023年，2月20日，星期一2.

定糖法

RNA的测定：.可在670-680nm波长下进行比色测定。

DNA的测定：.可在595-620nm波长下进行比色测定。第149页，共165页，2023年，2月20日，星期一核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脱氧核糖O核糖+H+糠醛甲基间苯二酚FeCl3绿色产物Δ脱氧核糖+H+

Δω-羟基-γ-酮戊醛二苯胺蓝色产物RNA和DNA定性、定量测定第150页，共165页，2023年，2月20日，星期一3.

定磷法

RNA和DNA中都含有磷酸，可以进行磷的测定。纯的核酸中含磷量在9.5%左右，因此，测出核酸中的磷含量就可计算核酸的含量。测定时先将核酸用强酸消化成无机磷酸，后者与定磷试剂中的钼酸反应生成磷钼酸，在经过还原作用而生成蓝色的复合物，最后在650-660nm进行比色测定。第151页，共165页，2023年，2月20日，星期一4.核酸的凝胶电泳凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法，有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者常用于DNA的分离分析，后者用于RNA的分离分析。第152页，共165页，2023年，2月20日，星期一第153页，共165页，2023年，2月20日，星期一第五节

核酸酶

Nuclease第154页，共165页，2023年，2月20日，星期一1.依据底物不同分类：DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)：RNA酶(ribonuclease,RNase)：2.依据切割部位不同：核酸内切酶：限制性核酸内切酶核酸外切酶：5´→3´或3´→5´核酸外切酶一、定义：核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。二、分类第155页，共165页，2023年，2月20日，星期一5´AGCTTCAGGATA3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´?核酸外切酶活性

第156页，共165页，2023年，2月20日，星期一GGATCCC