第二节基因工程的基本操作程序公开课

第二节基因工程的基本操作程序公开课第1页，共37页，2023年，2月20日，星期一苏云金芽孢杆菌（有抗虫特性）提取抗虫基因与运载体DNA拼接普通棉花植株导入基因工程培育抗虫棉目的基因的获得将目的基因导入受体细胞基因表达载体的构建重组质粒（重组DNA分子）抗虫性鉴定抗虫棉花植株目的基因的检测与鉴定第2页，共37页，2023年，2月20日，星期一第二节基因工程的基本操作程序第3页，共37页，2023年，2月20日，星期一1.目的基因（外源基因）：所感兴趣的基因一、目的基因的获取目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。第4页，共37页，2023年，2月20日，星期一2、获得目的基因的方法人工合成利用PCR技术扩增已知序列未知序列从基因文库获得供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因第5页，共37页，2023年，2月20日，星期一（1）人工合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成①化学合成法：目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)逆转录（逆转录酶）合成（DNA聚合酶）②

逆转录法：

当基因比较小、核苷酸序列已知或蛋白质的氨基酸序列可以测得时序列已知第6页，共37页，2023年，2月20日，星期一PCR(polymerasechainreaction)——聚合酶链式反应（2）利用PCR技术扩增目的基因根据DNA双链复制的基本原理，模拟体内复制过程，在生物体外复制特定DNA片段的技术第7页，共37页，2023年，2月20日，星期一体内PCR（体外）双链DNA双链DNA单链DNA解旋（解旋酶）单链DNA高温变性（加热至90～95℃

）合成RNA引物（RNA聚合酶）低温退火（复性）（冷却至55～60℃

）引物与单链互补结合适温延伸（加热至70～75℃

）双链子DNA热稳定ＤＮＡ聚合酶

分别以DNA的两条链为模板合成子链DNA聚合酶双链子DNA过程第8页，共37页，2023年，2月20日，星期一第9页，共37页，2023年，2月20日，星期一一次性吸液枪头调节轮卸枪头按钮推动按钮卸枪头器微量移液器第10页，共37页，2023年，2月20日，星期一利用PCR技术扩增目的基因第11页，共37页，2023年，2月20日，星期一四种脱氧核苷酸(dNTP)一对引物：热稳定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)Mg2+(激活剂)条件：缓冲溶液与目的基因的起始段互补有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物前提：2n循环n次后，共有DNA分子：第12页，共37页，2023年，2月20日，星期一（3）从基因文库中获取目的基因基因组文库cDNA文库过程提取基因组DNA限制性核酸内切酶酶切与运载体连接导入受体细胞mRNAcDNA(单链）双链DNA逆转录与运载体连接导入受体细胞

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。（序列未知）第13页，共37页，2023年，2月20日，星期一基因组文库部分基因文库文库类型基因组文库cDNA文库基因多少某种生物的全部基因某种生物的部分基因文库大小大小是否有非编码区有无是否有内含子有无第14页，共37页，2023年，2月20日，星期一①用一定的限制性核酸内切酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口；②用同种限制酶切断目的基因，产生相同的黏性末端；③将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使两者结合成重组质粒(重组DNA)。1.以质粒为载体，构建重组DNA的步骤：二、基因表达载体的构建——

核心第15页，共37页，2023年，2月20日，星期一质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA第16页，共37页，2023年，2月20日，星期一质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种第17页，共37页，2023年，2月20日，星期一2.基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因e、复制原点第18页，共37页，2023年，2月20日，星期一1.导入微生物细胞——

感受态细胞吸收DNA分子三、将目的基因导入受体细胞用冰冷的CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第19页，共37页，2023年，2月20日，星期一2.导入植物细胞（1）农杆菌转化法（双子叶植物和裸子植物）第20页，共37页，2023年，2月20日，星期一（2）基因枪法（单子叶植物）第21页，共37页，2023年，2月20日，星期一（3）花粉管通道法目的基因第22页，共37页，2023年，2月20日，星期一3.导入动物细胞——显微注射法受体细胞：受精卵目的基因第23页，共37页，2023年，2月20日，星期一四、目的基因的检测与鉴定抗虫对照第24页，共37页，2023年，2月20日，星期一四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因

检测目的基因是否转入受体细胞：载体的标记基因（抗性基因）第25页，共37页，2023年，2月20日，星期一1.检测目的基因是否插入转基因生物染色体：DNA分子杂交（一）分子水平第26页，共37页，2023年，2月20日，星期一用同位素标记的目的基因片段杂交（表明目的基因已转录出了mRNA）检测DNA利用的是与杂交，检测mRNA利用的是与杂交。2.检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交DNADNADNAmRNA提取受体生物的mRNA显出杂交带第27页，共37页，2023年，2月20日，星期一3.检测目的基因是否翻译成蛋白质:抗原抗体杂交第28页，共37页，2023年，2月20日，星期一（二）个体水平抗虫对照抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等第29页，共37页，2023年，2月20日，星期一第30页，共37页，2023年，2月20日，星期一

你能根据所学知识，设计构建会发荧光行道树的实验流程吗？这样的行道树白天可以遮阳，晚上可以作路灯照明。

萤火虫发光是发光器中的荧光素，在荧光酶的催化下发出的间歇光。荧光素和萤光酶都是由发光基因“指挥”合成的。转入荧光素酶蛋白基因的发荧光烟草第31页，共37页，2023年，2月20日，星期一D第32页，共37页，2023年，2月20日，星期一将目的基因转入植物细胞最常用的方法是：显微注射基因枪法花粉管通道发农杆菌转化法D第33页，共37页，2023年，2月20日，星期一获得转基因动物常用的受体细胞是：受精卵细胞皮肤细胞卵细胞造血干细胞A第34页，共37页，2023年，2月20日，星期一

质粒上有标记基因如上图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置（插入点a、b、c），请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是

A.①是c；②是b；③是cB.①是a和b；②是a；③是b

C.①是a和b;②是b；③是aD.①是c；②是a；③是b

A第35页，共37页，2023年，2月20日，星期一直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。1、电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。2、显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。3、直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。4、基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。间接导入法常用的载体是质粒、λ噬菌体、科斯质粒。1、质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。2、λ噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA可以作为目的基因的载体。3、科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和λ噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。第3