丝素蛋白纤维

3.2.4丝素蛋白及丝素纤维3.2.4.1蚕丝及丝素蛋白概述丝，通常是指由昆虫或蜘蛛所产生的纤维，也称“天然丝”。自然界中大约有30000种蜘蛛及113000种昆虫纲鳞翅目，大部分物种以及昆虫纲的其他几个物种可以吐丝。但时至今日，人们仅仅研究了少数几种蜘蛛、蚕类(包括桑蚕和柞蚕)和某些螨幼虫所吐出的丝类纤维和丝素蛋白，其中研究最多的是桑蚕丝(bombyxmoilsilk)和金丝蜘蛛络新妇(nephilaclavipes)的拖牵丝(dragline)和捕获丝(capturethread)o然而，直到现在人们还没有成功地开发蜘蛛丝，主要因为蜘蛛同类相食的本能致使人们不能对其进行高密度饲养。桑蚕是人类最早驯化的饲养的昆虫，蚕丝也是人类利用最早、目前产量最大的天然纤维之一，其蛋白质是迄今为止利用最早、研究最广泛的天然纤维蛋白。中国是蚕丝的故乡，发现并使用蚕丝已近有5000年的历史。蚕丝是一种具有优良特性的天然蛋白质纤维，它因具有独特的光泽、悬垂性、手感等而成为一种“高雅”的纺织纤维，素有“纤维皇后”的美誉。蚕丝中的丝素蛋白是一种天然蛋白质，且具有良好的生物相容性，在生物医学领域，除已用于外科手术缝线、食品添加剂和化妆品外，由于它独特的力学性能，使得蚕丝在临床上有着广泛的应用。(1)蚕丝及丝素蛋白的化学组成。蚕丝蛋白是由丝素蛋白(silkfibroin)和丝胶蛋白(sericin)两部分组成，疏水性的丝胶包覆在丝素蛋白的外部，约占重量的25%，而亲水性的丝素蛋白是蚕丝中的主要组成部分，约占重量的70%，蚕丝中还有5%左右的杂质。在丝素蛋白中含有18种氨基酸，以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为主。丝素中含有的氨基酸种类具体可参见表3—3。表3—3丝素蛋白氨基酸组成II每lOOg蛋白质中的氨基酸克数(g)ITOC\o"1-5"\h\zI名称II\o"CurrentDocument"II11II柞蚕丝素I桑蚕丝素III11II柞蚕丝素I桑蚕丝素II—I1亮氨酸(1eu)+-I10.40―F-I10.681I1II异亮氨酸(ne)1I0.381I0.871II—+-―F-1

由于蚕丝种类不同，柞蚕丝和桑蚕丝的丝素蛋白中氨基酸含量具有明显的差别，所用的仪器和测定方法不同，不同季节、不同产地蚕丝蛋白的氨基酸也会稍有差异。从表3—3中可以看出，柞蚕丝素蛋白组成中，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸的含量占氨基酸总量的82%以上，桑蚕丝素蛋白中以上三种氨基酸含量占氨基酸总量的85%以上。除了碳、氢和氮元素外，丝素蛋白还含有多种其他元素，如钾、钙、硅、锶、磷、铁、铜等，这些元素与丝素蛋白的性能及蚕吐丝的机理等有直接关系。丝素蛋白的相对分子质量。丝素蛋白属于纤维蛋白质，由于其分子结构和分子问作用力极其复杂，人们采用不同的方法对丝素蛋白分子的相对分子质量进行了多次测定，但是结果相差较大，而且早期对丝素蛋白分子链是由单一分子链组成还是由多个亚单元组成的复合体的问题也存在分歧。随着基因技术和测试技术的发展，近年比较统一的结论是，丝素蛋白由三个亚单元组成的复合蛋白质：包括重镀H链)蛋白亚单元，H链主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等组成，是由5263个氨基酸残基所组成的长链状分子，平均分子量为3.5X105；轻链(L链)亚单元，由262个氨基酸残基所组成，平均分子量为2.5X104；重链和轻链之间通过二硫键相连的蛋白，平均分子量为2.5X104,与L链大小相近，但氨基酸组成则完全不同，并且不与H链共价结合，只是通过其他非共价键结合方式作为丝素蛋白的微量成分存在。丝素蛋白的结构。丝素蛋白主要由甘氨酸，丙氨酸和丝氨酸等氨基酸组成。组成重链的12个结构域形成了蚕丝纤维的结晶区。但是由于这些结晶区被无重复单元的主序列打散，所以纤维中只有少数有序的结构域。纤维中的结晶结构域由甘氨酸一x氨基酸的重复单元组成，x代表丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。在蚕丝纤维中，一个结晶结构域平均由381个氨基酸残基组成。每个结构域又包含多个六缩氨酸组成的次结构域。这些六缩氨酸包括GAGAGS，GAGAGY，GAGAGA或GAGYGA(G是甘氨酸，A是丙氨酸，S是丝氨酸，Y是酪氨酸)这些次级结构域以四缩氨酸结尾，比如GAAS或GAGS。丝素重链里较少结晶形成的区域，也被称为连接区，长度在42〜44个氨基酸残基之间所有的连接区都有一个完全相同的25个氨基酸残基(非重复序列)，这些氨基酸残基由结晶区所没有的带电荷的氨基酸组成。主序列是形成具有天然共嵌段共聚物类似结构的疏水蛋白的主要原因。丝素蛋白结晶形态主要包括I型丝素和II型丝素：I型丝素分子链是按d一螺旋和卢一平行折叠构象交替堆积而成；II型丝素呈反平行卢一折叠层状结构。在温度和溶剂影响下，I型丝素易向I型丝素转变。存在于蚕丝素溶液一空气界面上的一种新的丝素结晶形态，称之为III型丝素，其肽链的立体构象为JB一折叠螺旋。I型丝素的结构是水溶态，通过加热或者物理纺织可以轻易转变成I型丝素结构。当I型丝素暴露在甲醇或氯化钾溶液中的时候，在体外液态环境里可以观察到I型丝素的结构转变为卢一折叠结构。1IB一折叠结构是由一侧为甘氨酸的氢和另一侧为丙氨酸的疏水性的甲基形成的非对称结构，口一折叠排列导致氢和甲基相互作用在晶区形成内折叠；强有力的氢键和范德华力产生的结构是热力学稳定的。氨基酸的分子内和分子间氢键垂直于分子链和纤维。I型丝素不溶于水，同时还不溶于多种溶剂，包括弱酸和碱性溶液以及一些离子液体。3.2.4.2丝素蛋白在生物材料方面的应用丝素蛋白是很早就为人类所重视的天然生物高分子，但自古以来，它的主要应用是在纺织业上。丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，从蚕丝中提取的丝素蛋白具有独特的分子结构，优异的力学性能、良好的吸湿和保湿性能以及抗微生物性能，同时可以方便地做成粒状、纤维状及膜状等形态，具有良好的生物相容性、无毒、无污染、可生物降解，为丝素蛋白在生物材料方面的开发利用提供了依据。丝素蛋白作为固定化酶载体的应用。在研究液状蚕丝素蛋白纤维化机理的过程中，人们发现，丝素蛋白的二次结构将会随着一定的物理或化学作用，如拉伸、剪切、加热、甲醇浸泡等，发生不可逆转的转化，即水溶性的丝素蛋白可通过物理或化学过程变成非水溶性的，这就为酶在丝素蛋白中的固定提供了可能。此类酶的固定化类似于凝胶包埋法，但其具有明显的优点：丝素蛋白变性的程度可以控制，因而减少了酶的渗漏和挤出，提高了固定酶的效率。另外，在固定化的过程中，只涉及极少的化学试剂并且不产生自由基，能较好地避免在普通凝胶包埋中所存在的化学试剂和自由基对酶产生的失活作用，大大增加了活性酶的利用效率。酶的固定化是指通过物理或化学方法将酶固定在某种载体上，使其成为仍具有催化活性的酶或酶的衍生物的过程，从而大大提高酶的使用效率。制备丝素固定化酶主要有包埋法和交联法。采用包埋法将葡萄糖氧化酶固定于丝素膜上，并以甲醇和戊二醛处理的丝素膜作为对照，结果表明：80%的甲醇处理的丝素膜比用戊二醛处理的丝素膜有更强的酶活性，且酶的活性可保持98%以上，酶的热稳定性和pH值稳定性都比自由状时增加。丝素膜的红外图谱显示，固定葡萄糖氧化酶(GOD)后，丝素膜的结构发生变化，甲醇处理前的丝素膜结构含有80%的无规卷曲和20%反向平行的口一折叠结构，这两种结构分别在丝素膜内部和外表面，根据核磁共振、傅立叶红外光谱等测得丝素膜为不均匀的结构，此结构可防止酶的溶出，这种结构使得丝素膜可保持酶活性一个月以上，在40°C时，酶性质稳定，而且由于葡萄糖在丝素膜内具有更高的扩散性，使酶也具有更高的活性恢复率。还有用丝素固定过氧化物(POD)和脂肪酶、果胶酶、青霉素酰化酶等制成酶固定化膜，这些酶固定化膜除具备各种高水平酶活性外，其保存时间较长，在酶不失活的情况下可保存两年以上，使酶膜难保存的缺点得以克服。由于采用丝素作为酶固定化材料，获得了更高的灵敏度和响应速度，这些对酶电极是十分重要的。丝素蛋白在药物释放上的应用。药物缓释技术是当前药剂学研究的热点之一，其目的在于寻求提供理想血液药物浓度的途径，提高药物的安全性和有效性。目前采用的控释基材大多用合成高分子材料，但其有许多弊端，而以丝素蛋白高分子材料作基材的控释体系具有明显的性能优势和应用优势，它们包括：丝素蛋白具有良好的力学性能和理化性质，如良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等。天然生物材料作为主要原料应用于医药行业的程序上有更多的便利条件。原料丰富、成本低廉。丝素蛋白为可生物降解材料，不造成环境污染。独特的氨基酸组成，可以通过某些氨基酸的氨基或侧链的化学修饰改变蛋白的表面性能。丝素蛋白在可控条件下可以顺利实现水溶性与非水溶性的双向转化，这是丝素材料独有的优越性能。丝素蛋白材料能够便利地为人体吸收，对人体无任何毒副作用。基于丝素蛋白作为缓释材料主要有以下几个缓释系统：微球/微囊药物缓释系统。目前，基于丝素蛋白作为缓释微球/微囊的材料主要集中于利用丝素蛋白与其他天然高分子材料复合制成缓释微球/微囊。比较常用的有丝素蛋白一壳聚糖微球/微囊，丝素蛋白一海藻酸盐微球/微囊等。复凝聚法是制备复合微球/微囊最常用的方法。复凝聚法制备的微囊药物包封率明显好于单凝聚法。同时复凝聚法包药微囊的缓释效果也优于单凝聚法。原因是复凝聚法制备的微囊是双层膜微囊，囊膜增厚，药物扩散距离增大；另外由于双层膜层问的存在，具有释药缓冲室功能；夕h层丝素膜可使内层壳聚糖膜的孑L隙部分堵塞从而使释药减慢。丝素微球/微囊的理化性能及药物缓释的行为主要与制备工艺有关。溶液的浓度、乳化条件、交联剂用量、溶液的pH值等条件对微囊的性能均有较大的影响。另外，微囊的形成及粒度大小的均匀性与乳化条件(乳化剂用量、乳化温度、搅拌速度)等密切相关。水凝胶药物缓释系统。在水凝胶药物释放系统中，药物通常以包埋或吸附的方式固定在凝胶中。当环境(如温度、pH值或离子强度等)改变时，由于溶胀作用，凝胶表面的孔洞变大，凝胶内外水分扩散途经打开，药物被释放。丝素蛋白的胶凝化过程是诸如疏水性相互作用、氢键、静电相互作用和微晶体的形成等多种因素综合作用的结果。作为一种天然蛋白质溶胶，丝素溶液在一定条件下会发生凝胶化，在这一过程中，丝素蛋白分子由无规卷曲转化成卢一折叠构象。随着p一折叠构象比例的增大，结晶度增加，丝素蛋白溶液成为稳定的凝胶。温度、pH值也是凝胶形成及其结构和性能的重要影响因素。相同浓度的丝素溶液在不同的温度条件下，凝胶化的时间、凝胶孔的尺寸以及力学性能均有所差异。当pH值接近于丝素蛋白的等电点时，丝素溶液凝胶化过程加快。载药膜缓释系统。丝素蛋白膜是一种天然的具有两性荷电性能的聚氨基酸膜。由于其本身具有特殊的多孔网状结构，因而具有优良的吸附及缓释功能。载药膜有单层药物丝素膜、复层药物丝素膜、涂层药物丝素膜。复层药物丝素膜比单层丝素膜在释放液中的初始释放浓度大，总释放时间延长。由于复合药膜中药物扩散途径较长，外层的丝素膜对药物的扩散有一定的阻挡作用进而延长释药时间，因而更符合药物缓释的要求。涂层药物丝素膜经涂层后，药物固定效果显著增强，“暴释”现象有了明显改善，药物释放趋缓。因而，涂层是提高丝素膜缓释效果的好方法。改变丝素膜外部pH值，可以调控离子化药物在丝素膜上的透过速度。当丝素膜电荷与药物离子电荷不同时，药物的渗透速度变慢；当丝素膜的电荷与药物电荷相同时，药物的透过速度加快。丝素蛋白在抗凝血物质上的应用。动物内脏中肝磷脂具有较强的抗凝血活性，它是一种硫化多糖，其分子中的磺酸基对抗凝血活性起重要作用。而丝素中含有许多由6种氨基酸残基交替排列的结构(Gly—Ala—Gly—Ala—Gly—Ser一)，当用浓硫酸处理丝素水溶液时，在规定时间内恒温下搅拌，使之发生反应，经NaOH中和反应并透析脱盐，冷冻干燥后获得硫酸化丝素粉末。然后用傅立叶红外光谱(Fr—IR)和核磁共振(1H—NMR)检测硫酸处理的丝素导人磺酸基的情况，结果表明丝素分子中的酪氨酸或丝氨酸的羟基被硫酸酯化，形成的硫酸酯基在1100〜1400cm。处有强烈吸收峰，说明丝素中被导人磺酸基。硫酸处理丝素与无处理丝素相比，显示出抗凝血活性。且使用氯化硫酸来代替浓硫酸，得到的抗血液凝固活性高约100倍，使活性提高到肝细胞的20%左右。由于这种物质可低价制造，不仅可作为防止血液凝固的试用药，也可利用其来提高人工血液的抗凝固机能。丝素具有抗凝血性能，可以此开发人造血管和抗血栓药物。采用低温等离子体技术，可以在材料表面引入特定的官能团以赋予材料优良的表面性能。采用二氧化硫等离子体处理在丝素蛋白膜引入磺酸基团，或丝素蛋白膜用氨气等离子体处理后，利用1，3一丙磺酸内酯与氨基的反应在材料表面接枝磺酸基团。采用x光电子能谱和全反射红外光谱分析材料的表面性质，结果表明两种处理方法均能在丝素蛋白膜表面有效地接枝磺酸基团，而且材料的抗凝血性能有显著提高。经过等离子体处理并和交联剂反应后抗体可以有效地接枝到丝素蛋白膜上去，并且接枝上去的抗体经多次冲洗后仍然保持相当的数量，这表明抗体以共价键的形式牢固地接枝上去。一般说来，这样制成的硫酸化蚕丝使血液在2h内也不会凝固，并且成本大大降低。从而使人造血管的制造与应用具有广阔的前景。如将丝素溶液干燥成膜时，把具有抗血凝固性能的药品加人其中，就有可能制造人造血管。蚕丝还被制成微粒作为血管栓塞的栓塞剂在临床上广泛应用。丝素蛋白在组织工程支架上的应用。皮肤组织工程。因丝素蛋白具有良好的柔韧性、透水性、透气性、与创面的黏附性以及与人体很好的相容性，可用作人工皮肤。人的皮肤由表皮层和真皮层构成，表皮层在外层，真皮层在内层，当真皮层被破坏后，皮肤不会再生，这时需要进行皮肤移植，除了患者本人自己的皮肤，移植来的皮肤一般极难生长愈合，因此，现在人工皮肤的开发研究也仅能用来治疗真皮尚存的情况。目前研制的丝素创面保护膜，具有良好的柔韧性、透水性、透气性、与创面的黏附性以及与人体的生物相容性，可将药物从膜中先快后慢地释放出来，具有抑菌杀菌作用和创面覆盖材料保护创面的作用。静电纺丝素蛋白纳米纤维膜仿生天然细胞外基质具有高的孔隙率和高的表面积，研究结果表明，静电纺丝素蛋白纳米纤维对细胞的黏附、增殖、分化和迁移会产生重要的影响。以甲酸为溶剂静电纺制备的丝素蛋白纳米纤维膜能促进人体角质细胞和成纤维细胞增殖、分化，用于伤口敷料和皮肤再生。肌腱与韧带组织工程。韧带由束状致密结缔组织构成，能介导正常的关节运动及维持关节稳定。由于蚕丝的强度和弹性系数与生物的肌腱有近似的数值，又具有良好的生物亲和性、弹性及韧性，且用丙烯酸处理蚕丝，使其分子结构发生改变后能很容易地吸收钙。因此，丝素蛋白可望用于开发人工肌腱与人工韧带。一种方法是直接将蚕丝纤维用于人工十字韧带(anteriorcruciateligaments，ACL)的制作：将30根单丝组成1根复丝，每6根复丝成1根线，再3根线成1股，6股成一束，然后直接用作ACL基质。经扫描电子显微镜(SEM)、DNA定量以及胶含量等测试显示，这样做成的支架能支持成人骨髓基质干细胞(BMSCs)的生长和扩散、分化。蚕丝纤维具有良好的力学性质、生物相容性以及缓慢的降解性，是制作人工韧带的良好支架材料。丝蛋白纤维上引入磷酸基团时，能够吸收钙离子，从而可用于制造人工肌腱。因为其能够吸附在羟基磷灰石(骨头的主要成分)上形成很强的结晶，钙的凝集量比未处理的丝素蛋白有大幅度的增加，而且这些经过修饰的丝纤维有良好的拉伸性能。另一种方法是采用交替浸泡法使得磷灰石沉淀到丝纤维上，从而得到这种很有潜力的生物材料。软骨和骨组织工程。由于软骨、骨组织形态、结构的多样性，长期以来软骨、骨缺损的修复都是再生医学的难点之一。近年来大量的研究报道了应用丝素蛋白支架修复多样的软骨、骨缺损。丝素蛋白水凝胶、静电纺纳米纤维膜、多孔三维支架等都可以引导软骨、骨缺损的修复。采用静电纺的方法制备的纳米纤维膜能促进老鼠前成骨细胞(MC3T3一E1)黏附、增殖、分化，培养14d后，细胞和丝素膜完全成一个整体，并且丝素膜植入到有颅盖骨缺陷的新西兰白兔的体内，丝素膜能诱导骨钙素的产生，促进骨组织修复和再生。将人骨髓基质干细胞种植于丝素蛋白做成的三维多孑L丝素蛋白支架植人鼠头盖骨创伤模型，说明丝素蛋白可用于骨重建和再生，表现出机械稳定性和持久性。并且通过用不同孑L隙直径的丝素蛋白支架培养人骨髓基质干细胞，分别比较112〜224斗m和400〜500斗m两种孔隙直径的丝素蛋白支架材料，发现可通过支架几何学形状控制骨组织工程构建。如果在丝素蛋白中导人带电化合物，可加速其与钙、磷酸根的凝集，进一步将带有负电荷的羟基磷灰石结晶中的基团紧密凝聚，其钙凝集量比未处理的丝素蛋白有显著增加，用这种方法在丝素表面形成结晶物，经x射线透射验证含有人骨的主要成分，证明丝素蛋白具有骨结合性和附着性。神经组织工程。周围神经损伤是临床常见疾患，致残率非常高，给病人、家庭和社会带来巨大的经济损失和精神负担。因此，如何促进神经的再生、恢复靶器官的功能一直是人们关注的热点。利用生物材料构建的神经再生支架，不仅可以为神经细胞获取营养、生长和代谢提供了一个有利的空间，还具有减轻缝合口的张力，引导神经纤维的生长，提高神经束对合的精确度，防止瘢痕组织侵入再生的神经纤维等优点。南通大学顾晓松课题组将丝素蛋白纤维与老鼠背根神经节及老鼠坐骨神经中提取的雪旺细胞共培养，发现丝素蛋白与它们有很好的生物相容性，在细胞表型和功能方面无显著的细胞毒性，可支持大鼠背根神经细胞生长。同时，丝素蛋白基神经导管用于老鼠体内桥接10mm长的坐骨神经缺损，种植6个月后的周围神经修复的结果表明，丝素蛋白支架能促进周围神经的再生并接近自体神经移植的结果。同时丝素蛋白可负载神经生长因子，从含有神经生长因子(NGF)的水溶液中，采用冷冻干燥的方法制备负载NGF的神经导管，NGF的释放可以至少3周以上，缓释液能促进PCI2的增殖和分化，保持生长因子的生物活性。.⑤血管组织工程。因丝素蛋白具有良好的生物相容性和一定的抗凝血性能，常用于研究血管组织工程支架。将丝素涂覆在聚酯纤维的表面，然后将这种材料注入活犬的大腿静脉中进行活体试验，结果对血栓的形成有抑制作用。用丝素蛋白纤维制备的三层小口径血管桥接到老鼠的腹部动脉，发现内皮细胞和平滑肌细胞迁移到支架上，随着时间的增加，逐步形成了组织。为了提高丝素蛋白管状支架的力学性能，通过静电纺丝法构建了PLA/丝素明胶复合管状支架，丝素明胶层由直径为(143±36)nm的不规则取向的纳米纤维组成，纤维之间有大量孔隙存在，孔隙的平均直径为161±55)nm；PLA层由(1337±427)nm的微米级纤维组成，纤维排列取向较好，平均孑L径达(1223±374)nm，整个复合管状支架的孔隙率达(82±2)%，具有较高的强度和较好的柔软性