现代分子生物学技术

现代分子生物学技术第1页/共133页

基因操作DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因的人工合成基因的定点突变PCR扩增等核心技术第2页/共133页第3页/共133页（一）三大成就：1、40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；一、发展历程及基础第4页/共133页2.50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；RosalindFranklinX-ray光源DNAMauriceWilkins成像1953-Franklin&Wilkins第5页/共133页3.50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。JacobandMonod第6页/共133页（二）两大技术保证：1.DNA的体外切割和连接1962年Arber

发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了DNA连接酶限制性酶连接酶第7页/共133页2.DNA的核苷酸序列分析技术第8页/共133页二、DNA操作技术

（一）核酸的凝胶电泳基本原理：一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比,与分子的摩擦系数成反比第9页/共133页DNA和RNA被称为多聚阴离子（polyanions），核酸分子放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。大分子量的DNA移动的慢小分子量的DNA移动的快电泳缓冲液阳极阴极DNA加样孔第10页/共133页第11页/共133页琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间第12页/共133页聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1到1000个碱基对之间第13页/共133页凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝胶浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强；反之浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。第14页/共133页在紫外线的照射下结合溴化乙锭（简称EtBr）的DNA分子发出荧光,每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA也可以被清晰地检测出来。第15页/共133页称样溶解加热制板倒胶电泳操作基本程序第16页/共133页取样点样电泳检测第17页/共133页结果分析第18页/共133页（二）核酸的分子杂交将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。DNA/DNA或DNA/RNA第19页/共133页不同温度下DNA的构型变化第20页/共133页在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“印迹杂交”。第21页/共133页

材料：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）步骤：第一，将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印迹转移、电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法;第二，是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交第22页/共133页SouthernBlotting的过程（1）碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA（2）通过电泳液的移动转移胶中的DNA（3）固定胶中的DNA（4）预杂交和杂交（放射性和荧光检测）（5）结果检测1、SouthernBlotting（DNA印迹技术）

第23页/共133页常用的荧光染料：C5、C3等第24页/共133页2.Northernblotting（RNA印迹技术）是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。分离的mRNA(不同长度)探针DNA结合第25页/共133页3.Westernblotting（蛋白质杂交技术）将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应。主要步骤：蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：硝酸纤维素滤膜靶蛋白的免疫学检测第26页/共133页Step1.靶蛋白于第一抗体（一抗）反应Step2.与标记的第二抗体（酶标二抗）反应Step3.显色反应：酶促反应第27页/共133页4、原位杂交（insituhybridization）DNA的定位RNA定位第28页/共133页将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点:能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态第29页/共133页核酸原位杂交的基本步骤细胞或组织的固定：载玻片组织细胞杂交前的预处理:用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质探针的选择和标记杂交杂交结果检测第30页/共133页检测重组体克隆的菌落杂交技术第31页/共133页5、探针的标记探针的种类:根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。标记物:核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素第32页/共133页缺口平移法（1）双链DNA探针第33页/共133页当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3‘羟基末端。同时该酶具有从5‘→3’的核酸外切酶活性,能从切口的5‘端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3‘端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。第34页/共133页随机引物法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。产物平均长度为400-600个核苷酸。第35页/共133页（2）单链DNA从M13载体衍生序列合成单链DNA探针从RNA合成单链cDNA探针（3）寡核苷酸探针（4）末端标记DNA探针（5）RNA探针第36页/共133页从M13载体衍生序列合成单链DNA探针第37页/共133页从RNA合成单链cDNA探针第38页/共133页第39页/共133页所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。（三）细菌转化第40页/共133页步骤：1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。第41页/共133页2.与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复5.涂布于选择性培养基中分离转化子。第42页/共133页第43页/共133页

1、

基本原理：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右,一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；第44页/共133页②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；靶序列引物1引物25’3’5’5’3’5’3’靶序列3’第45页/共133页靶序列靶序列引物1引物25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA互补的链。第46页/共133页第一次PCR循环的结果是产生两个靶序列的复制。第47页/共133页1cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824第48页/共133页第49页/共133页（2）DNA聚合酶在核苷酸底物的存在下，以一条DNA链为模板催化新链的合成需要具有3’-OH的引物具有5’到3’方向聚合的能力通常具有3’到5’

外切酶活性Taq

DNA聚合酶在70～80℃具有最高聚合活性第50页/共133页(3)镁离子浓度:Taq酶活性需要Mg2+，Mg2+浓度过高导致非特异扩增，一般常用1.5mmol/L(4)底物浓度:dNTP浓度在20～200mol/L，四种dNTP必须浓度相等(5)PCR反应的缓冲溶液:提供合适的酸碱度和某些离子：10～50mmol/LTris-HCl缓冲液、50mmol/LKCl、明胶第51页/共133页PCR仪第52页/共133页（五）核苷酸序列分析1.

Sanger双脱氧链终止法(dideoxy-terminationsequencing)原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。第53页/共133页不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来第54页/共133页AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG5’3’添加DNApolymerase所有4dNTPs其中一种标记的ddNTP在四个不同的反应管中各只包含一种ddNTP.ddTTPddCTPddGTPddATP第55页/共133页AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG

5’3’TTCGATTCGATTTCGATTTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGAT反应C反应G

反应A反应每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs处5’第56页/共133页反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基.电泳结构通过显色指示.

T

C

GA3’CCTTTAGCT5’第57页/共133页过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影（该法亦适合mRNA的序列分析）。GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。第58页/共133页1）模板制备:可自动化2）定序反应:可自动化3）凝胶电泳:自动化有一定困难4）核苷酸序列阅读与计算机输入:可自动化2.DNA序列测定的自动化第59页/共133页第60页/共133页1.

凝胶阻滞试验:凝胶阻滞试验（gelretardationassay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNAmobilityshiftassay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。（六）DNA与蛋白质相互作用研究第61页/共133页在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。第62页/共133页凝胶阻滞实验的基本原理图ACB放射自显影****凝胶电泳放射性标记的DNA细胞蛋白质提取物蛋白质与DNA结合******BDNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢滞后带表明DNA与蛋白质结合第63页/共133页

在DNaseI足迹试验（DNAfoot-printingassay）过程中，首先将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链的单个末端标记的双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA链只发生一次磷酸二酯键断裂。2.

DNaseI足迹试验第64页/共133页如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端1个、2个、3个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的连续的DNA片段梯度群体。如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么，它就将保护这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹”。第65页/共133页32p1510*14810*加入蛋白质X加入DNaseI凝胶电泳放射自显影1510AB足迹(a)(c)(b)DNaseI足迹实验第66页/共133页作业：1、凝胶电泳的原理是什么？有哪两种，分辨范围各是多少？凝胶的浓度和分辨率的关系是什么？2、什么是核酸分子杂交？几种杂交方法的过程各是什么？3、探针的类型有哪些？叙述一种探针的制作过程。4、什么是细菌转化？其步骤如何？5、什么是基因体外扩增？步骤如何？6、Sanger双脱氧链终止法的原理和过程各是什么？第67页/共133页（七）实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。第68页/共133页实时荧光定量PCR的几种方法介绍：1、SYBRGreenI法：SYBRGreenI是一种只与DNA双链

的小沟部位结合的荧光染料。第69页/共133页基本过程是：开始反应，当SYBRGreen染料与DNA双链结合时发出荧光。DNA变性时，SYBRGreen染料释放出来，荧光急剧减少。在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。聚合完成后，SYBRGreen染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。第70页/共133页

2、TaqMan探针技术TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。第71页/共133页在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter,R)，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。第72页/共133页第73页/共133页通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析：CT值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的PCR循环次数第74页/共133页第75页/共133页确定未知样品的C(t)值后通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量第76页/共133页通过一系列酶作用，使总mRNA转变成双链cDNA并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。（八）RNA基本操作技术第77页/共133页1、总RNA的提取Trizol试剂(苯酚-异硫氰酸胍）提取法：液氮研磨材料，匀浆，加入Trizol试剂进一步破碎细胞并溶解细胞成分；加入氯仿抽提、离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，获得比较纯的mRNA；通过OD260和OD280测定RNA的纯度和浓度，并用含有甲醛的凝胶电泳检测RNA.第78页/共133页2、mRNA的纯化寡聚-纤维素柱色谱法；

Promega公司的PolyATTtractmRNA分离系统第79页/共133页将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。第80页/共133页3、cDNA的合成第一链的合成：以mRNA为模板，反转录成cDNA，由反转录酶催化，并由oligodT作引物。OligodT引物由12～20个dT构成，后面加上一个具有XhoⅠ等酶切位点的连接引物。第81页/共133页在cDNA合成过程中，应选用活性较高的反转录酶及甲基化dCTP，保证新合成的cDNA链被甲基化修饰，以防止构建克隆时被限制性内切酶切割；cDNA两端应加上不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得双链cDNA的方向性。第82页/共133页第二链的合成：以第一链为模板，由DNA聚合酶催化，以RNaseH切割杂合链中的mRNA序列产生的小片断为引物，由DNA连接酶连接成完整的DNA链。同时加入另一个酶切位点的黏性接头（EcoRⅠ)，与cDNA连接后用XhoⅠ酶切。第83页/共133页第84页/共133页4、cDNA文库的构建：基因重组5、基因文库的筛选：核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法第85页/共133页（九）SNP的理论与应用单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。第86页/共133页通常所说的SNP都是二等位多态性的，这种变异可能是转换（CT，在其互补链上则为GA），也可能是颠换（CA，GT，CG，AT），具有转换型变异的SNP约占2/3；转换的几率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。第87页/共133页1、根据SNP在基因组中的分布位置可分为：基因调控区SNP(pSNP)；基因间随机非编码区SNP(rSNP)；基因编码区SNP(cSNP)。第88页/共133页基因编码区SNP(cSNP)分为两种：一种是同义cSNP（synonymouscSNP），即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP（non-synonymouscSNP），指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。第89页/共133页2、SNP的特点:①密度高：SNP在人类基因组的平均密度估计为300～1000bp,在整个基因组的分布达3×106

个,遗传距离为2--3cm,密度比微卫星标记更高,可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。②富有代表性：某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平,因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。第90页/共133页③遗传稳定性：与微卫星等重复序列多态性标记相比,SNP具有更高的遗传稳定性。④易实现分析的自动化：SNP标记在人群中只有两种等位型(allele),故也称为双等位标记(biallelicmarker)。这样在检测时只需一个"+/-"或"全/无"的方式,而无须象检测限制性片段长度多态性,微卫星那样对片段的长度作出测量,这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化。第91页/共133页3、SNP的检测分析技术（1）基因芯片技术(genechips)

基因芯片又称DNA芯片(DNAchips)或生物芯片(biologicalchips)，是用标记的探针与特定的DNA样品杂交,然后通过检测杂交信号的强弱判断样品中靶分子的数量。第92页/共133页基因芯片检测技术的主要过程:首先,用生物素标记扩增后的靶序列或样品,然后再与芯片上大量的探针进行杂交;其次,用含链霉素的荧光素作为显色物质,图像的分析则用激光共聚焦显微镜或其他荧光显微镜对片基扫描,由计算机搜集荧光信号,并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。第93页/共133页（2）Taqman技术利用Taq酶的5’

核酸外切酶活性,切割与PCR扩增产物结合的DNA探针,此探针带有一个供体-受体荧光染料对,两者能发生荧光共振能量转移(FRET)。Taq酶切割使供体染料与淬灭的受体染料分离,结果使供体染料的荧光极大增强。第94页/共133页（3）分子信标技术供体和受体荧光染料分别位于有互补序列的探针两侧,当未与靶序列杂交时,探针形成一个"发夹环"结构,使供体-受体染料对相互靠近而产生淬灭。反之,探针与正确的靶序列杂交时,染料对分离,荧光信号可增强至900倍。第95页/共133页（4）焦磷酸测序法是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理如下：

第1步：一个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。第96页/共133页第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。第97页/共133页第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。第98页/共133页第99页/共133页第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。第100页/共133页第5步：加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。第101页/共133页第102页/共133页（十）基因克隆技术1、RACE技术：在已知cDNA序列的基础上克隆5’端或3’端缺失序列的技术。（1）获得高质量总RNA；（2）去磷酸化作用；（3）去掉mRNA的5’帽子结构，并以RNA连接酶连接上特异RNA寡聚接头；第103页/共133页（4）以特异性寡聚dT为引物，在反转录酶的作用下合成第一条cDNA链；（5）分别以第一条cDNA链为模板进行RACE反应；（6）将纯化后的PCR产物克隆到载体DNA中，进行序列分析。第104页/共133页2、克隆基因的分离（1）应用核酸探针分离克隆目的基因把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的分离或筛选。应用核酸探针分离目的基因的方法叫作核酸杂交筛选法。第105页/共133页（2）应用cDNA差示分析法克隆基因RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群（representation），保证绝大部分遗传信息能被扩增。第106页/共133页（3）基因的图位克隆法首先，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。其次，通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。然后，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cm（厘摩）相当于1%的重组率。第107页/共133页（十一）基因敲除技术基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。第108页/共133页1、完全基因敲除指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因的活性的基因敲除。实验室采用取代型或插入型载体在ES细胞中根据正负双向选择原理进行实验：第109页/共133页正向选择基因neo通常被插入到载体靶DNA功能最关键的外显子中或通过同源重组法置换靶基因的功能区，其功能是：形成靶位点的插入突变；作为正向筛选标记。负向选择基因HSV-tk置于目的基因外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长。第110页/共133页完全基因敲除动物模型的基本步骤：第111页/共133页①基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，成为重组载体。②ES细胞的获得：现在基因敲除一般采用是鼠胚胎干细胞。常用的鼠的种系是1２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。第112页/共133页③同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。④选择筛选已击中的细胞：正负筛选法（PNS法），第113页/共133页⑤表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。⑥得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中，所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。第114页/共133页第115页/共133页2、条件性基因敲除法将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。第116页/共133页利用Cre/LoxP和来自酵母的FLP—frt系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型;通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP的(“loxPfloxed”)ES细胞产生“loxPfloxed”小鼠;然后，通过将“loxPfloxed”小鼠与Cre转基因鼠杂交产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠;第117页/共133页在“loxPfloxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP