重组技术基础

重组技术基础第1页，共66页，2023年，2月20日，星期三与基因工程学科建立相关的1、4个里程碑事件：2、3大技术发现/发明：第2页，共66页，2023年，2月20日，星期三第二章重组ＤＮＡ技术基础第3页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA组成与结构一级结构碱基的排列顺序二级结构DNA的双螺旋形式高级结构DNA的超螺旋形式核酸分子组成DNA的分子结构第4页，共66页，2023年，2月20日，星期三（一）核酸的分类90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸

核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。第5页，共66页，2023年，2月20日，星期三１.戊糖（构成RNA）1´2´3´4´5´-D-呋喃核糖(ribose)（构成DNA）-D-2-脱氧呋喃核糖

(deoxyribose)第6页，共66页，2023年，2月20日，星期三2.碱基嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)腺嘌呤(adenine,A)鸟嘌呤(guanine,G)第7页，共66页，2023年，2月20日，星期三核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR3.核苷(ribonucleoside)碱基——核糖（脱氧核糖）

连接方式：C——N糖苷键碱基（9/1位）——戊糖（1，位）

1´1第8页，共66页，2023年，2月20日，星期三核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

４.核苷酸(ribonucleotide)核苷（脱氧核苷）——磷酸磷酸酯键第9页，共66页，2023年，2月20日，星期三5´端3´端５.核苷酸的连接３，－５，磷酸二酯键CGA第10页，共66页，2023年，2月20日，星期三二、核酸的一级结构定义：

核酸中核苷酸的排列顺序（碱基序列）。5′端3′端CGA第11页，共66页，2023年，2月20日，星期三AGP5PTPGPCPTPOH3书写方法5pApCpTpGpCpT-OH

35

ACTGCT

3

竖式横式简化式第12页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA的空间结构第13页，共66页，2023年，2月20日，星期三一、DNA的二级结构

（一）双螺旋结构第14页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）两条DNA单链分子反向平行环绕，右手螺旋走向，表面大沟与小沟相间。螺旋直径为2nm，主链：戊糖－磷酸骨架位于外侧

侧链：碱基对位于内侧碱基平面垂直于螺旋轴碱基距：0.34nm；螺距：3.4nm；周长：10对碱基。第15页，共66页，2023年，2月20日，星期三碱基形成氢键配对，配对形式为：A=T;GC）。第16页，共66页，2023年，2月20日，星期三碱基互补配对TACG第17页，共66页，2023年，2月20日，星期三稳定因素：1.氢键维持横向稳定性，2.碱基堆积力维持纵向稳定性。3.介质中阳离子可以有效地屏蔽磷酸基之间的静电斥力

第18页，共66页，2023年，2月20日，星期三（二）与DNA碱基顺序相关的特殊结构碱基顺序颠倒重复而具有2倍对称的DNA段落第19页，共66页，2023年，2月20日，星期三第20页，共66页，2023年，2月20日，星期三第21页，共66页，2023年，2月20日，星期三镜像重复序列第22页，共66页，2023年，2月20日，星期三tsDNA是在DNA双螺旋结构的基础上形成的，三条链均为同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy），即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶。（三）三股螺旋DNA

（tsDNA,也称H-DNA

）

第23页，共66页，2023年，2月20日，星期三Py-Pu-Py型，在偏酸性pH中稳定，较多见

第24页，共66页，2023年，2月20日，星期三(四)酶活性DNA1995年Cuenoud等发现了具有酶活性的DNA，再次丰富了酶学。Cuenoud根据共有序列设计并合成了由47个核苷酸组成的单链DNA-E47，以此连接两个底物DNA——S1和S2第25页，共66页，2023年，2月20日，星期三第26页，共66页，2023年，2月20日，星期三二、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装（一）DNA的超螺旋结构超螺旋结构(superhelix或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反第27页，共66页，2023年，2月20日，星期三意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。第28页，共66页，2023年，2月20日，星期三（二）原核生物DNA的高级结构第29页，共66页，2023年，2月20日，星期三（三）DNA在真核生物细胞核内的组装真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体(nucleosome)。DNA：约200bp

组蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4核小体的化学组成第30页，共66页，2023年，2月20日，星期三第31页，共66页，2023年，2月20日，星期三第32页，共66页，2023年，2月20日，星期三RNA的结构StructureofRNA第33页，共66页，2023年，2月20日，星期三RNA的种类、分布、功能第34页，共66页，2023年，2月20日，星期三mRNArRNAtRNA第35页，共66页，2023年，2月20日，星期三一、mRNA的结构与功能hnRNA内含子(intron)mRNA

外显子(exon)第36页，共66页，2023年，2月20日，星期三*真核细胞mRNA结构特点5´末端有甲基化鸟苷帽子结构：m7GpppNm-

2.3´末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。第37页，共66页，2023年，2月20日，星期三帽子结构第38页，共66页，2023年，2月20日，星期三促进mRNA由胞核向胞质的转位维持mRNA的稳定性翻译起始的调控帽子结构和多聚A尾的功能第39页，共66页，2023年，2月20日，星期三*mRNA的功能把DNA的碱基序列翻译成蛋白质的氨基酸顺序。DNAmRNA蛋白转录翻译原核细胞细胞质细胞核DNA内含子外显子转录转录后剪接转运mRNAhnRNA翻译蛋白真核细胞第40页，共66页，2023年，2月20日，星期三*

tRNA的一级结构特点含10~20%稀有碱基，如DHU3´末端为—CCA-OH5´末端大多数为G

具有TC二、转运RNA的结构与功能第41页，共66页，2023年，2月20日，星期三*tRNA的二级结构——三叶草形

氨基酸臂

DHU环

反密码环额外环

TΨC环氨基酸臂额外环第42页，共66页，2023年，2月20日，星期三*tRNA的三级结构——倒L形*tRNA的功能活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。第43页，共66页，2023年，2月20日，星期三*rRNA的结构三、rRNA的结构与功能*rRNA的功能参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。第44页，共66页，2023年，2月20日，星期三rRNA的种类真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNAS（沉降系数）：单位时间内的沉降速度第45页，共66页，2023年，2月20日，星期三核酸的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid第46页，共66页，2023年，2月20日，星期三1.核酸的溶解度核酸是极性分子，微溶于水，不溶于乙醇或异丙醇。DNA+蛋白质→脱氧核糖核蛋白（DNP）：在1mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。RNA+蛋白质→核糖核蛋白（RNP）：在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。一、核酸的一般理化性质第47页，共66页，2023年，2月20日，星期三

核酸属于两性电解质，但因为磷酸的酸性较强，因此总体呈现较强的酸性。具有较低的等电点。当溶液的pH4时，呈多负离子状态，容易与金属离子结合形成盐。2.酸碱性第48页，共66页，2023年，2月20日，星期三3.核酸的高分子性质粘度：DNA>RNAdsDNA>ssDNA4.核酸的紫外吸收(OD260)单核苷酸>ssDNA(或RNA)>dsDNA第49页，共66页，2023年，2月20日，星期三第50页，共66页，2023年，2月20日，星期三5.核酸的化学性质核酸中的嘌呤和嘧啶能进行脱氨、聚合、烷基化等反应等。脱氨：C→U第51页，共66页，2023年，2月20日，星期三脱氨：C→UATCGAATTGCATUGAATTAC千万年后，G–C将不复存在第52页，共66页，2023年，2月20日，星期三聚合紫外光诱导两个相邻嘧啶之间形成二聚体第53页，共66页，2023年，2月20日，星期三二、DNA的变性(denaturation)定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：OD260增高 粘度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失第54页，共66页，2023年，2月20日，星期三DNA变性的本质是双链间氢键的断裂第55页，共66页，2023年，2月20日，星期三例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。第56页，共66页，2023年，2月20日，星期三热变性解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。第57页，共66页，2023年，2月20日，星期三Tm：DNA变性时紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(meltingtemperature,Tm)。第58页，共66页，2023年，2月20日，星期三影响Tm的因素：1.G+C含量:

G+C越高，Tm越高

2.DNA样品均一性：

均一的DNA样品，Tm范围较狭窄。

3.核酸的种类：

双链RNA＞RNA-DNA杂交链＞DNA双链

4.溶液的离子强度：

离子强度高，Tm值高。第59页，共66页，2023年，2月20日，星期三三、DNA的复性与分子杂交

DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。减色效应

DNA复性时，其溶液OD260降低的现象。