pcr说明与注意事项

pcr说明与注意事项第一页，共43页。PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K.Mullis），他于1983年发明了PCR技术，这是分子生物学上的一次革命，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。第二页，共43页。PCR技术的基本原理1,变性：一般93～95度2,退火：一般55度左右，根据具体的情况决定3，延伸：一般72度,PCR产物每kb一分钟pcr.swf.swf第三页，共43页。常用的PCR技术普通PCRRT-PCRRacePCR巢式PCRReal-timePCR第四页，共43页。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：

(1)生成双链DNA中的特异序列作为探针；

(2)由少量mRNA生成cDNA文库；

(3)从cDNA中克隆某些基因；

(4)生成大量DNA以进行序列测定；

(5)突变的分析；

第五页，共43页。我们可以利用PCR做些什么工作克隆基因，构建质粒扩增核酸，用于检验质粒点突变连接(overlapPCR)第六页，共43页。要将两段100多个碱基的片段连起来用PCR可以吗？？没有酶切位点！各位高手可否介绍一下经验？？连接PCR要注意些什么？？多谢！！！(丁香园某求助帖）

第七页，共43页。可以。我就这样做过。

1.针对这两个片段设计两对引物。第一对引物的下游引物和第二对引物的上游引物各长40bp左右，并有20bp左右的同源性配对序列（象骨折打的石板）。

2.分别PCR这两段序列，并分别回收纯化这两个PCR片段。

3.将上述两个PCR片段加入一PCR体系中，只不加引物，其他同普通的PCR，做PCR。

4.回收200多bp的PCR目的片段。放入测序载体，测序证实。(丁香园某回答贴）

第八页，共43页。overlapPCR第九页，共43页。在设计引物之前应当明确PCR试验的目的以及各种资料和信息1.引物长度一般为18-35bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性

2，上下游引物长度相差一般不超过3个碱基primersdesign第十页，共43页。3.引物GC含量尽量是40％－60％4.尽量避免发卡结构，特别是3‘端发卡结构

5.尽量避免引物二聚体特别是3‘端引物二聚体

第十一页，共43页。6，尽量避免错配，特别是3‘端错配7，尽量避免3‘端最后一个碱基是A。8，上下游Tm值相差最好不要超过5°C第十二页，共43页。9，Tm值的计算：Tm＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）(本公式适用于20个碱基以下，20个碱基以上推荐使用软件计算）10,根据需要可在引物5‘端加入酶切位点和保护碱基第十三页，共43页。11,引物设计的最后一项：Genebank网比对/Blast第十四页，共43页。使用软件帮助设计引物目前常用的引物设计软件有PrimerPrimier5.0和Oligo以及其他各种软件和一些网上在线设计，其中以PrimerPrimer5.0功能最全最为常用。PrimerPrimer5.0的主要功能有：分析限制性内切酶位点，自动搜索，手动设计等功能。

第十五页，共43页。关于PCR引物设计的思考

1，任何引物设计软件都不能代替人性化的思考。2,核酸结构是三维的，而一般的引物设计软件很难考虑到核酸的三维结构。3，理论与实践并不一定完全一致

关于PCR试验结果的思考

第十六页，共43页。影响PCR的主要因素怎样理解PCR技术？1，模板模板在PCR反应中起至关重要的作用，常见的模板性质：A质粒DNAB基因组DNACRNA(RT-PCR)第十七页，共43页。2，引物引物的特异性很重要3，引物浓度0.1~1pmol/ul引物浓度太低PCR产量低，引物浓度太高容易引发非特异性扩增。第十八页，共43页。Mg离子的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用

并能影响Polymerase的活性，一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜

Mg离子浓度第十九页，共43页。Mg离子浓度升高则PCR特异性增加，Mg离子降低则有可能出现非特异性扩增退火温度升高退火温度PCR产量低，降低退火温度则有可能出现非特异性扩增第二十页，共43页。保护碱基的个数：(NEB)BamHⅠ1EcoRⅠ1HindⅢ2XhoⅠ1PstⅠ3XbaⅠ1保护碱基的性质：灵活处理关于酶切位点与保护碱基第二十一页，共43页。本实验室经常使用宝生物的Taq酶rTaq：普通Taq酶，1kb以下片断使用比较合适DNA聚合酶的选择第二十二页，共43页。EX－Taq具有一定的保真性，2kb以下片断使用比较合适

LA－Taq保真性比EX－Taq要好，适用于2kb以上的片断第二十三页，共43页。1，具有3‘－5’核酸外切酶活性，所以具有保真性2，PCR产物末端没有T3,扩增效率往往不如普通Taq酶，可以用普通Taq酶和pfu按20：1混合使用关于高保真DNA聚合酶（pfu）第二十四页，共43页。PCR究竟能扩多长的片段？RNA模板：使用一般的试剂，RT-PCR一般只能扩到2kb左右质粒模板：5kb一般不成问题基因组DNA模板：使用特殊的酶和缓冲液原理上讲可以扩出10～25kb(长距离PCR）

第二十五页，共43页。RT-PCR第二十六页，共43页。各有优缺点。比较如下：二步法:可使用oligo(dT)，随机六聚体引物或基因特异性引物进行第一链合成。高灵活性：可选用不同的酶系统。可优化困难的RT-PCR反应。可实现长模板mRNA的转录扩赠(使用ELONGASEEnzymeMix)。最适用于克隆产物(使用高确限度酶或混合酶)。

一步法和二步法第二十七页，共43页。一步法:第一链合成时只能使用基因特异性引物。高灵敏度：使用预混合的SUPETSCRIPTH和Taq聚合酶，可检测到低至0．1pg的mRNA。高便利性：所使用的酶已经预混合。移液步骤少，减少污染机会。最适于大量样品的分析。第二十八页，共43页。总的原则：1，做任何实验要有对照2，做任何实验要变通，走多条路，不要在一棵树上吊死。

PCR反应条件的摸索第二十九页，共43页。不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，

④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

不出现扩增条带第三十页，共43页。出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带

与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。

第三十一页，共43页。对策有：①必要时，重新设计引物。②减低酶的量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸，也叫两步法)。

第三十二页，共43页。出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓

度。④增加模板量，减少循环次数。

第三十三页，共43页。模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

第三十四页，共43页。

hotstartPCR

热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，热启动PCR尤为有效。

第三十五页，共43页。利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3一5个(dC)残基5‘Race技术第三十六页，共43页。含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物与cDNA第一链配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP2genespecificprimer,GSP)作为下游