生物学DNA克隆技术

生物学DNA克隆技术第1页/共171页第二章

DNA克隆技术第2页/共171页1、克隆：——无性繁殖

一种无性繁殖技术。指由一个细菌和细胞，通过分裂繁殖所产生的一系列遗传结构完全相同的群体。前言一、定义：第3页/共171页克隆羊：个体水平细胞克隆：细胞水平DNA克隆：分子水平单克隆抗体：分子水平第4页/共171页卵细胞C母绵羊子宫Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵细胞细胞拆合技术妊娠第5页/共171页2、DNA重组/基因重组利用酶学方法，将不同来源的DNA分子（目的DNA分子和载体）在体外进行特异切割、重新连接，组装成一个新的DNA分子。第6页/共171页3、DNA克隆/基因克隆/分子克隆将重组的DNA通过一定方式导入宿主细胞内，并且在宿主细胞中进行复制扩增，形成大量与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。第7页/共171页4、基因工程基因工程(geneticengineering)——有目的的通过基因克隆技术，人为的操作改造基因，以改变生物的遗传性状的系列过程。第8页/共171页遗传学角度：一项遗传学技术将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，创造生物新品种或新物种的遗传学技术无性繁殖：称之为“克隆”行使正常功能：称之为“表达”第9页/共171页第10页/共171页生物化学角度：重组载体的操作在体外，将各种来源的DNA片段与载体DNA结合成一个重组载体；重组载体可转化或转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达，产生特定的基因产物。DNA片段：同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的载体DNA：病毒、细菌质粒或噬菌体第11页/共171页二、应用：1、获得大量DNA拷贝2、体外生成蛋白质3、基因治疗第12页/共171页第一节概论一、历史1944肺炎双球菌转化实验——DNA是遗传物质1953DNA双螺旋模型——DNA复制的机制1960’s遗传密码

——中心法则1970反转录酶

——cDNA的合成1946-质粒

——重组载体1968-70限制酶

——工具酶1972Berg重组DNA分子1973Cohen重组DNA的转化筛选第13页/共171页ThetransformingprincipleisDNA.DNAisthegeneticmaterialHistoryofDNAcloning第14页/共171页FrancisH.CrickJamesD.WatsonHistoryofDNAcloning第15页/共171页HistoryofDNAcloning第16页/共171页中心法则HistoryofDNAcloning第17页/共171页

质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒都是环状构形。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。第18页/共171页限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。第19页/共171页HistoryofDNAcloningBergP.,the1stDNAcloning

SV40EcoRILambdaDNAT4DNALigase第20页/共171页RecombinantDNATechnologyBoyerandCohen,1973HistoryofDNAcloningEcoRIT4DNALigase第21页/共171页二、基因克隆的特点和技术路线1、特点：分子水平上操作，细胞水平上表达2、技术路线：分：分离制备目的DNA片段和载体切：目的DNA与载体的剪切接：目的DNA与载体的连接转：重组DNA分子转化宿主细胞筛：筛选阳性克隆，大量扩增第22页/共171页基因克隆技术路线第23页/共171页3、基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

第24页/共171页第二节工具酶工具酶：基因克隆研究工作中，用以切割、连接和修饰DNA或RNA的一类酶，是克隆的基本工具。包括核酸限制性内切酶、连接酶、聚合酶、反转录酶等。第25页/共171页重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基第26页/共171页一、限制性内切酶1、定义内切：在双链DNA内部切割限制性：识别特异序列，在特异位点切割

GAATTCCTTAAGEcoRⅠ酶切位点第27页/共171页2、命名酶的来源Haemophilusinfluenzaed

属名种名株系酶的名称HindⅠ特异性甲基化酶

ⅡGTPyPuACⅢAAGCTT流感嗜血杆菌d株第28页/共171页3、分类

ⅠⅡⅢDNA底物双链DNA

双链DNA

双链DNA

辅因子Mg2+ATPSAMMg2+Mg2+ATP识别序列特异特异特异切割位点非特定特定特定识别序列前后之中之后25bp~27bp

100-1000bp修饰作用有无有第29页/共171页4、特点Ⅱ型限制酶：

4~8个核苷酸切口概率星号活力

回文结构

平端切口粘性末端

1/44＝1/2561/46＝1/40961/48＝1/65536GGATCCCCTAGGBamHⅠ①②③第30页/共171页如EcoRI切割后产生5′末端突出的粘性末端；

5′－G↓AATTC－3′5′－G-OH

p-AATTC－3′3′－CTTAA↑G－5′3′－CTTAAG－5′PstI切割后产生3′末端突出的粘性末端：

5′－CTGCA↓G－3′5′－CTGCA-OHp-G－3′3′－G↑ACGTC－5′3′－GACGTC－5′还有一些酶沿对称轴切割DNA，产生平端或钝端（bluntend）如SmaI:

5′－CCC↓GGG－3′5′－CCCGGG－3′3′－GGG↑CCC－5′3′－GGGCCC－5′第31页/共171页第32页/共171页GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGGCCTAATCCGG+BstⅠ（识别序列相同，但切割位点可以相同或不同）第33页/共171页第34页/共171页第35页/共171页

7、限制片断的末端连接作用

分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。

分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。第36页/共171页分子内连接分子间连接第37页/共171页二、聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）2、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段Klenow3、T4噬菌体DNA聚合酶4、TaqDNA聚合酶第38页/共171页5’3’DNA聚合酶活性第39页/共171页3’5’外切活性5’3’

外切活性第40页/共171页5、反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）

催化以RNA为模板反转录生成DNA。最初禽类成髓细胞中分离。主要用于反转录mRNA生成cDNA。RNA指导的DNA合成反应；RNA的水解反应；DNA指导的DNA合成反应。AMV：42℃PH8.3MLV：37℃PH7.6①分类②作用③活性第41页/共171页反转录酶具有RNaseH活性第42页/共171页第43页/共171页5′－G↓AATTC－3′5′－G－OH

p-AATTC－3′3′－CTTAA↑G－5′3′－CTTAA-p

OH-G－55′－G－OH。。。p-AATTC－3′3′－CTTAA-p。。。OH-G－5T4DNAligaseRE第44页/共171页

2、连接酶的来源

1）DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码

粘末端连接

NAD+供能

第45页/共171页

2）T4DNAligase：

大肠杆菌T4噬菌体DNA编码可连接粘性末端可连接平末端（已知唯一可连接平末端的DNA连接酶）最适pH：7.2-7.8需要ATP参加反应

第46页/共171页五、T4多核苷酸激酶催化ATP的γ－P一个一个依次加到DNA的3’

末端。ATP第47页/共171页六、末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）催化dNTP一个一个依次加到DNA的3’

末端。小牛胸腺分离。第48页/共171页七、碱性磷酸酶

催化DNA、RNA、NTP、dNTP的5’磷酸基团

。小牛小肠、细菌中分离。第49页/共171页基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

第50页/共171页第三节目的基因与载体第51页/共171页Ⅷ因子两端正好有两个酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ，切割后得到1500bp的片段。适用于基因结构简单的原核生物中的多拷贝基因。一、目的基因1、染色体DNA的限制性内切酶酶切片段第52页/共171页2、通过mRNA反转录合成cDNA逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT第53页/共171页基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌3、从基因组DNA文库获取目的基因第54页/共171页限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库第55页/共171页mRNA

cDNA

双链cDNA

重组DNA分子

cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制4、从cDNA文库获取目的基因第56页/共171页8、最常用的方法：？？5、PCR扩增目的基因6、人工体外合成基因片段——1.20RMB/bp7、根据蛋白质序列推导索取第57页/共171页基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

第58页/共171页二、载体（一）定义：

能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子（二）特性：复制起点(ori)多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点筛选标志：Amp+Kan+Neo+分子量不宜过大：否则易断裂、转化效率低表达载体：还要有P、E、前导序列、加尾信号、信号肽、核定位序列等

第59页/共171页（三）载体种类1、功能克隆载体:克隆一个基因或DNA片断表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把基因插入到染色体组中报告载体：携带报告基因2、来源：

质粒载体噬菌体载体病毒载体

细菌和酵母染色体第60页/共171页

（四）质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。第61页/共171页存在于细菌等细胞质中

双链环状DNA分子

大约3～10Kb

具有自主复制和转录能力

不能独立存活

在子细胞中保持恒定的拷贝数

并表达其遗传信息

1、特性第62页/共171页<15kb

一般3～10Kb左右

2、接受的DNA片段长度第63页/共171页3、常用质粒pBR3224361bp

TetrAmprpUC18/19

2686bpAmprLacZpGEM-3Z

2743bpAmpr

LacZpUC118/1193162bpAmprLacZ第64页/共171页主要用于外源基因的克隆和保存，是一种比较原始的克隆载体。pBR322：B,bacteria;R,Resistance.以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。pBR322第65页/共171页pUC18/19主要用于外源基因的克隆和保存，由美国UC科学家于1993年构建是一种比较好的克隆载体，目前还广为应用。lacZ’第66页/共171页pBK-CMV第67页/共171页pEGSH第68页/共171页pSG5第69页/共171页pUC118/119第70页/共171页pWE15第71页/共171页pBCKS+/-第72页/共171页pPROTet.E第73页/共171页（五）噬菌体（bacteriophage）

感染细菌的病毒第74页/共171页λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）M13噬菌体DNA改造系统：M13mp系列pUC系列特点：约50kb，容纳18～22kb片段线性双链，天然粘性末端感染宿主细胞能力强容易筛选、贮存第75页/共171页线形双链DNA分子，

50kb左右

两端12碱基互补的单链，天然黏性末端，cos位点。

由壳蛋白包装1、特性λ噬菌体第76页/共171页λphage48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)

溶菌阶段(复制和释放)

溶源阶段

(整合到寄主染色体上)第77页/共171页DNAProteincoatcoscosNonessential

regionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bp第78页/共171页可接纳较长片段：18～22kb壳蛋白包装，具有感染宿主细胞的能力，片段为载体的70～105％（15～25kb）均可成熟。易筛选，易贮存。

2、接受的DNA片段长度第79页/共171页第80页/共171页根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选第81页/共171页3、常用噬菌体载体EMBLcharonλgt第82页/共171页M13单链DNA噬菌体的生命周期M13噬菌体第83页/共171页M13克隆载体分子结构图第84页/共171页（六）病毒载体1.逆转录病毒载体2.慢病毒载体3.腺病毒载体4.腺相关病毒载体6.单纯疱疹病毒载体第85页/共171页病毒载体的构建原则重组病毒一般是用于基因治疗，因此病毒载体多为减毒的，即复制缺陷性的，在正常细胞中不能复制，只能表达所携带的基因。由于病毒载体基因组比较庞大，难以直接将目的基因酶切插入病毒基因组。一般是先构建穿梭质粒，然后与亲本病毒共转染包装细胞，获得复制缺陷性病毒，分离纯化。病毒载体的大量制备必须要包装细胞(packagingcells).第86页/共171页1）逆转录病毒（retrovirus,RV）

RV是目前基因转移中应用最为广泛的一类病毒。是一类RNA病毒。由于缺失了自身包装所必需的蛋白（结构蛋白gap，多聚酶pol，包膜糖蛋白env）基因，因此其复制需依赖辅助细胞系。逆转录病毒转染效率高，理论上可高达100%。病毒载体的特点第87页/共171页Retrovirus

逆转录病毒

第88页/共171页第89页/共171页（1）两端各有一长末端重复序列LTR。

逆转录病毒前病毒的结构特点

（2）LTR由U3、R和U5三部分组成。（3）病毒有三个结构基因（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。

（5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。

(1)在U3内有增强子和启动子；

(2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS)

；(3)在R内还有poly(A)加尾信号。

(1)gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；(2)pol基因，编码逆转录酶；(3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

第90页/共171页逆转录病毒介导的基因转移系统

——由两部分组成：

(1)逆转录病毒载体

(2)辅助细胞株(如PA317)第91页/共171页Retroviralpackagingsystem第92页/共171页

包装细胞（pakagingcell）包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gag、pol、env所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不能产生任何形式的病毒颗粒。第93页/共171页逆转录病毒载体介导基因转移的一般过程：1）目的基因克隆到逆转录病毒载体上；2）带有目的基因的逆转录病毒载体通过物理方法如磷酸钙介导或电穿孔法导入已选定的包装细胞；3）根据载体所提供的筛选标记基因筛选转化细胞；4）选择具有高滴度重组病毒的转化细胞，分离重组病毒；第94页/共171页5）重组病毒感染靶细胞，采用两种方式，一种是以无细胞带病毒上清和靶细胞一起温育；另一种以产病毒的包装细胞经射线照射致死后作为饲养细胞，被靶细胞在其上面培养达到目的。6）如采用体外感染，则将感染的细胞回输体内，分析治疗基因的表达及治疗效果；7）病毒感染的质量控制，在基因转移过程中要进行严格的质量控制。第95页/共171页逆转录病毒载体的特点

感染宿主范围广：逆转录病毒表面的糖蛋白能被很多哺乳动物细胞膜上的特异性受体所识别，因而可以高效率地将基因转移到被感染的细胞内。

表达时效长：被转移的外来基因能整合进被感染细胞的基因组中而不丢失，有利于被转移基因的永久保存。优点缺点特异性差只能感染正在分裂的细胞。载样量小：最大可以装载8-10kb大小的外来基因。随机整合，具有一定的致癌性。第96页/共171页

2）腺病毒(adenovirus，AV)载体

腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。

腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。第97页/共171页第98页/共171页生活周期第99页/共171页腺病毒载体的优点1.对人类安全。美国长期应用腺病毒进行免疫疫苗接种无导致严重疾病的记录。2.腺病毒特异性受体较普遍地存在于哺乳动物细胞膜上，宿主范围广泛。腺病毒既感染分裂的细胞，也感染不分裂的细胞，基因治疗应用范围大，而且感染效率很高，最高可达100%。3.被转移的遗传物质不整合进被感染细胞的基因组内，无激活癌基因或灭活抑癌基因的危险。第100页/共171页腺病毒载体的优点4.由于腺病毒能感染呼吸道和消化道，所以可通过吸入或口服的方式进行基因转移。5.易于制备和纯化，很容易获得高滴度的重组腺病毒，有利于直接活体基因治疗。6.腺病毒载体最大可装载7-8kb左右大小的外来基因。第101页/共171页腺病毒载体的缺点1.表达时效短：由于腺病毒载体转移基因不整合进细胞的基因组中，随着细胞的分裂，细胞内的转移基因逐渐丢失。2.包膜有免疫原性：虽然由腺病毒诱发的免疫反应有利于开展肿瘤免疫方面的基因治疗，但它引起的免疫排斥反应不利于反复治疗。3.特异性差：宿主范围广泛是腺病毒载体的一个优点，但同时特异性差又是它一个缺点。很难以腺病毒载体针对某一特定组织进行基因治疗。4.构建载体复杂第102页/共171页3)腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV）AAV属于微小病毒家族成员，是一类小的单链DNA病毒（基因组约4.7kb），非常稳定。本身无致病性，需辅助病毒（常为AV）存在时才能复制。AAV可感染人的细胞，并能整合至非分裂相细胞。第103页/共171页StructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒复制基因,CAP:编码衣壳蛋白的基因第104页/共171页AAV的特点●以潜伏感染为主；●病毒基因组与细胞共存；●只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；●若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制；●产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。第105页/共171页AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。

第106页/共171页

AAV载体的缺陷：

AAV载体容量小，目前最多只能容纳5kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低。在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。第107页/共171页4）单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus,HSV）HSV是一些双链DNA病毒（基因组约150kb），具有嗜神经细胞的特性，能在神经细胞内形成“终生隐性感染”。将外源基因导入并使之长久存在于中枢神经系统是该类病毒载体的一大特点。第108页/共171页缺点：（1）构建复杂（2）对人体有致病性，危险性高，需慎重。优点：

（1）可感染分裂或非分裂期细胞（2）载样量大（4）不整合，但可长期稳定表达第109页/共171页基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的切割克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

第110页/共171页第四节切目的基因与载体的剪切——同种酶1、目的2、限制性内切酶的选择

A、目的基因两端存在的位点

B、载体的多克隆位点第111页/共171页3、策略

粘性末端：

5’突出末端3’突出末端

5’3’5’3’5’3’5’3’第112页/共171页

粘改平：

5’凹端削平（核酸酶S2），

3’凹端补齐（DNA多聚酶Ⅰ）5’3’DNApolⅠ5’3’5’3’5’3’核酸酶S25’3’5’3’第113页/共171页

平端切口：难于连接，效率低，无方向性5’3’5’3’5’3’5’3’T4DNAligase5’3’5’3’第114页/共171页

平改粘：人工接头(linker)

衔接子(adaptor)

同聚物加尾法GGGGGCCCCCTargetgeneGGGGGCCCCCvectorCTTAAGGGATCCTargetgeneGGATCCGAATTCvector第115页/共171页策略

粘性末端

平端切口

粘改平

平改粘目的

连接第116页/共171页基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

第117页/共171页（一）平末端连接产生：酶切补齐法削平法优点：解决无法解决的问题缺点：载体自身环化双向插入多拷贝插入

效率低，酶用量高第五节接第118页/共171页目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连第119页/共171页（二）同源粘末端连接形成：同一种酶同尾酶优点：效率高一种酶缺点：载体自身环化双向插入多拷贝插入对策：载体DNA片断的脱磷酸化处理

限制酶鉴定第120页/共171页BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连第121页/共171页

粘性末端DNA片断的连接由于具粘性末端的载体易发生自连。载体的5’末端处理：碱性磷酸酶脱磷酸基团外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。第122页/共171页第123页/共171页Pst1Pst1Pst1Pst1酶切鉴定DNA片断的插入方向

粘性末端连接的双向插入第124页/共171页（三）定向克隆（最常用）定义：使目的基因片段定向插入载体分子中的方案方法：双酶切由平末端改造优点：防止载体自身环化正向插入单拷贝插入连接效率高同聚物加尾法衔接子(adaptor)接头(linker)第125页/共171页

1、同聚物加尾法用5’

核酸外切酶处理DNA片断在A和B分别中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40个碱基第126页/共171页CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ2、人工接头(linker)连接第127页/共171页第128页/共171页衔接子连接法第129页/共171页第130页/共171页基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

第131页/共171页第六节转转入宿主细胞质粒DNA/重组DNA细胞表型改变第132页/共171页☻导入方式转化（transformation）：质粒或以其为载体的重组子导入细菌并得到表达的过程。转染（transfection）：重组噬菌体或病毒导入宿主细胞的过程。转导（transduction）：重组DNA经过外壳蛋白包装后转入宿主细胞的过程。第133页/共171页1、转化作用(transformation)：质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌并得到表达的过程。第134页/共171页2、转染(transfection)：重组噬菌体或病毒导入宿主细胞的过程。第135页/共171页3、转导作用(transduction)：以噬菌体为媒介，重组DNA经过外壳蛋白包装后转入宿主细胞的过程。第136页/共171页一、宿主细胞☻受体细胞原核：大肠杆菌（DH5α、JM系列、HB101、SSD）枯草杆菌真核：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞

☻受体菌条件安全宿主菌处于感受态——易获得外源DNA的状态限制酶和重组酶缺陷对重组子的复制和扩增没有严格的限制第137页/共171页二、转化的原理和过程（一）氯化钙法1、原理：

细菌在低温和低渗环境，通透性增加，膨胀成球形，此时转化混合物中的DNA形成羟基－钙磷酸混合物黏附于细胞表面，经短暂热休克，促进细胞吸收重组子。第138页/共171页2、过程：对数期细菌置于冷Cacl2、Mgcl2中→感受态加入重组质粒，冰浴30分钟，不要震荡42℃水浴60~90S，热休克马上冰浴3、特点：

转化效率低，1%的转化效率

105～106转化子/μgDNA第139页/共171页（二）电穿孔法1、原理：

对数生长中期细菌，冷却离心，用低盐缓冲液充分洗涤，降低细胞悬液的离子强度，用10％甘油重悬细胞，使其浓度为3×1010个/ml，即可用于电穿孔法转化。0～4℃操作，室温转化效率低。2、特点：

优点：细菌制备较氯化钙法容易转化效率较高缺点：需要特殊仪器条件不易掌握细胞杀伤率高第140页/共171页（三）转染试剂法

1、阳离子型脂质体

1）转染试剂：

单价：lipofectin、lipofectACTTM

、dostap

多价：dosper、infectAmineTM等

2）特点：转化效率高细胞毒性低转化细胞类型广操作简单易行价格昂贵第141页/共171页2、DEAE－葡聚糖

1）转染试剂：

二乙胺四乙基葡聚糖——高分子多聚阴离子试剂促进哺乳动物细胞捕获外源DNA2）操作：重组子＋试剂→复合物→处理细胞试剂处理细胞→重组子转染

3）特点：用于克隆基因地瞬时表达，不易形成稳定细胞系一定的细胞毒性用于传染小量DNA第142页/共171页（四）显微注射

DNA准确注入细胞最可靠的方法。借助电脑更为精确。特点：昂贵每次注射细胞数量有限第143页/共171页基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

第144页/共171页第七节筛抗药性筛选：amprtetr

kanr插入表达筛选蓝白斑筛选测序菌落或噬菌斑杂交筛选酶切鉴定：插入否？插入方向？第145页/共171页1、抗生素平板筛选感受态细菌连接混合物42℃0℃转化Amp＋未转化Amp－平板培养再筛选Amp＋Tet－阳性Amp＋Tet＋假阳性ABCD假阳性重组子阳性转化菌载体自身环化非目的基因插入载体酶切不完全未转化菌阳性克隆LB＋琼脂糖＋Amp阴性第146页/共171页2、插入表达筛选CIMCSOriAmprtargetgene第147页/共171页3、蓝白斑筛选感受态细菌连接混合物42℃0℃转化E－未转化E＋平板培养第148页/共171页第149页/共171页原位杂交4、杂交筛选第150页/共171页5、酶切鉴定DNA片断的插入方向正反MPst1Pst1Pst1Pst1oriori6、测序准确，但成本高。第151页/共171页重组DNA技术操作过程可形象归纳为:小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体第152页/共171页重组DNA技术操作的主要步骤载体目的基因（外源基因）酶切开环载体DNA目的基因连接转化筛选回收培养第153页/共171页第八节实验技术

煮沸法碱裂解法SDS法原理：强碱性环境、SDS

细菌染色体DNA变性质粒仍呈天然状态中性高盐离心蛋白变性沉淀沉淀：染色体DNA、蛋白质上清：质粒一、质粒的提取及纯化第154页/共171页细菌培养物，5000rpm离心5分钟，收集沉淀↓弃上清加入100μl预冷solI振荡10～15↓加200μl新鲜配制solII颠倒数次混匀，冰浴5分钟↓加150μl预冷的solIII,颠倒数次混匀，冰浴,10分钟↓12000rpm离心10分钟↓上清转移至一新1.5ml管中,加等体积的酚:氯仿:异戊醇↓剧烈振荡混匀(抽提)20秒，12000rpm离心10分钟↓上清转移至一新1.5ml管中,加2~2.5倍体积的无水乙醇混匀↓冰浴10min↓12000rpm离心10分钟↓弃上清,用75%的乙醇洗涤沉淀一次↓

12000rpm离心5分钟↓弃上清,沉淀↓用20μlTE溶解沉淀第155页/共171页第156页/共171页酶切体系DNA样品1μlEcoRⅠ1μl10×bf1μl

水7μl10μl活力单位(IU):

一般5IU/μl

取1μl的酶可以消化5μM的DNA二、限制酶切割第157页/共171页bp1350─974─750─550─370─250─载体质粒目的基因重组质粒

酶切第158页/共171页注意：低温保存，冰上操作。贮存环境是甘油，避免反复冻融。酶量不能超过反应体积的1/10。无菌新的dorf管、枪头、去离子三蒸水。DNA样品：一定纯度，不能混有酚氯仿EDTASDS过多盐类等反应缓冲液：合适的pH值、盐离子浓度，配套提供温度和时间：37℃1-2h终止反应：EDTASDS加热-20℃第159页/共171页

低熔点琼脂糖凝胶回收法

羟乙基修饰凝固温度30℃溶化温度65℃

胶回收三、核酸片段的回收与纯化第160页/共171页浓度：1OD260=50μg/ml双链DNA=40μg/ml单链DNA/RNA=20μg/ml寡核苷酸纯度：DNA纯品OD260/OD280=1.8RNA纯品OD260/OD280=2.0四、核酸定量第161页/共171页常用：T4DNA连接酶反应体系：越小越好10