PCR生物化学课件

多聚酶链反应PCR-polymerasechainreaction

实时荧光定量PCR技术

利用DNA变性与复性原理在体外扩增特异DNA片段,在一个简单的试管中反应，用极少量基因组DNA作模板,在一对引物介导下，通过聚合酶链式反应，在短时间内即可将所需目的DNA片段扩增至100万倍以上PCR技术特点

敏感度高、特异性强、产率高、重复性好、操作简便、快速

PCR工作原理是以要扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5`末端和3`末端相互补的寡核甘酸片段为引物、在4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下，依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR特异性取决于人工合成的一对引物和模板DNA结合的特异性。

反应分三步：1变性

denaturation：加热90-95℃，模板DNA双链解离形成单链DNA；2退火annealling：

温度突然降低,引物与模板DNA结合,40-60℃,Tm值{4（G+C）+2（A+T）}-5℃.

3延伸

extension：

TaqDNA聚合酶以4dNTP为底物，在Mg2+存在的条件下，催化DNA合成。70-75℃时间---要扩增片段长度决定循环次数取决于模板DNA的浓度30次—扩增100万倍引物设计原则引物长度15-30bp引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45-55%左右。引物的内部不应形成二级结构，两个引物间不应有互补链存在引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。计算机分析。引物3`末端碱基原则上与模板配对，3`末端碱基最好不是A。引物5`末端碱基无严格限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，末端可以游离。因此可以在引物5`末端加上限制性内切酶位点。

PCR技术应用目的基因的克隆基因的体外突变DNA的微量分析

PCR技术结合分子生物学实验技术---PCR新技术，RT-PCR：用于RNA分析PCR-SSCP：可用于点突变分析热启动PCR：可提高特异性。不对称PCR（asymmetricPCR）多重PCR(multiplexPCR)巢式PCR(nestedPCR)实时荧光定量PCR技术

实现了PCR从定性到定量的飞跃实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高实时监测反应过程Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量PCR所使用的荧光化学荧光染料

SYBRGreenI

荧光探针

TaqMan荧光探针

MoleculaeBeacons

ScorpionsTM探针

Lightcycler

SYBR荧光染料在PCR反应体系中，加入过量SYBRGreenI荧光染料，SYBRGreenI荧光染料特异性地掺入DNA双