化学生物学导论-第三章核酸4-5节课件

第三章

核酸NucleicAcid

DNA碱基顺序的测定

RNA碱基顺序的测定第四节

核酸碱基序列顺序分析

(Sequenceanalysisofnucleicacids)DNA碱基顺序测定的基本步骤DNA片断的制备DNA碱基顺序测定

杂交测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法DNA芯片法

化学降解法

(Maxam-Gillbert法,1977)双脱氧链终止法

(sanger法,1977)新技术方法核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis经典方法一、以化学裂解反应为基础—化学降解法基本原理：基于有机化学方法，选择性地切断核苷酸（A、G、C或T）所形成的磷酸二酯键，得到不同链长的DNA小片段；将这些片段经电泳分离；分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。主要两个步骤：碱基选择性水解；对水解产物DNA小片段进行电泳分析和碱基顺序的推断。硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中嘌呤碱基选择性水解，分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：N3-甲基腺嘌呤核苷和N7-甲基鸟嘌呤核苷；肼：使DNA分子中嘧啶碱选择性水解，胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存在下水解，核糖腙3´-位的磷酸酯键则被水解断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。特异性碱基化学切割反应(1)化学裂解法测定DNA的核苷酸序列返回二、以使用DNA聚合酶为基础--DNA链末端终止法

基本原理：以DNA的酶促合成为基础，以被测DNA单链为模板，通过特殊设计的“末端终止技术合成出一系列相差一个核苷酸长度的互补链，然后利用凝胶电泳分离这些不同长度的DNA小片段，以此推测确定待测DNA链的碱基顺序。主要步骤包括：末端终止法合成不同长度DNA小片段；DNA小片段电泳图谱解析。1977年sanger发明末端终止法“加减法”Sanger双脱氧终止法DNA酶法测序DNA自动测序仪Sanger法发展过程*少一个－OH脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸结构2、双脱氧链终止法基本原理：☺直接引入双脱氧核苷三磷酸作为链终止剂；☺将待定DNA片断分为4组，在反应体系中仍然以DNA单链为模板，需要引物、

DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种用32P/35S标记)、一定比例不同种类的终止剂2，3-双脱氧三磷酸(ddNTP，特异性末端终止剂)；☺在DNA合成反应混合物的4种dNTP加入少量的一种ddNTP后，链的延伸将与偶而发生但却非常特异的链终止竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。分别得到ddAddTddGddC结尾的片段。返回DNA酶法测序三、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。ddNTPs参与下的DNA复制Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP：dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；“标记／终止法”测序产物的平均长度可通过标记反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反应的ddNTP:dNTP来调整。第二步荧光检测DNA带负电DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关DNA自动测序结果RNA碱基顺序测定方法RNA链碱基顺序的测定比较复杂；逆转录法，以待测的RNA链为模板，在逆转录酶纯化下，合成DNA(与RNA互补的DNA分子，常用cDNA表示)；用化学降解法

或双脱氧链终止法测定DNA碱基顺序，再得出RNA的碱基顺序。应用一套已知序列的寡核苷酸探针去寻找靶DNA链上的互补序列，靶DNA上的序列根据杂交情况来确定。杂交测序核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料，经水解，测定核苷酸组成及比例；先以外切酶确定5′-或3′-末端核苷酸，再以内切酶将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷酸组成、比例和序列；最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个核酸分子的核苷酸序列。核酸碱基顺序测定酶底物作用部位作用产物外切酶磷酸二酯酶DNA，

RNA5′端，5′连接处3′核苷酸3′端，3′连接处5′核苷酸内切酶脱氧核糖核酸酶IDNA3′连接处3′-羟核苷酸为3′末端寡核苷酸及剩余部分脱氧核糖核酸酶II5′连接处3′-核苷酸为3′末端寡核苷酸及剩余部分核糖核酸酶T1RNA5′连接处碱基是G3′-鸟苷酸为3′末端寡核苷酸及剩余部分核糖核酸酶I5′连接处碱基是

Pyr3′-嘧啶类核苷酸为3′末端寡核苷酸及剩余部分核苷酸序列分析中断裂磷酸二酯键用酶返回第五节

核酸的催化性质

Thecatalyticpropertiesofnucleicacids核酶（Ribozyme）核酶的发现核酶的催化性质核酶的研究中的两个问题核酶的发现Altman发现RNase-P的蛋白部分不具催化功能，而RNA部分在有足够浓度Mg2+离子存在下，能起核酸水解酶的作用。Cech发现RNA原生动物四膜虫的Pre-rRNA是一种具有自催化性能的核酶。证明了核酸既是信息分子，又是功能分子

核酶催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。催化性RNA(ribozyme)

序列特异性的核酸内切酶参与RNA转录后加工修饰作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解mRNA。

核酶的催化性质RNA作用于RNA核酸酶催化的反应主要包括:水解反应(RNA限制性内切酶活性)，连接反应(聚合酶活性)和转核苷酰反应等。最近核酸酶的其他作用底物也已被发现，如多糖、DNA以及氨基酸酯等。核酶的催化过程图转酯作用转酯作用核酸酶是指所有可以水解核酸的酶依据底物不同分类DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)RNA酶(ribonuclease,RNase)依据切割部位不同分类核酸内切酶：

限制性核酸内切酶非特异性核酸内切酶核酸外切酶：

5´→3´或3´→5´核酸外切酶。参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸在消化液中降解食物中的核酸以利吸收体外重组DNA技术中的重要工具酶生物体内的核酸酶负责催化细胞内外核酸的降解

核酸酶的功能

ThecrystalstructureoftheL1ligaseribozyme.(Credit:M.RobertsonandW.Scott(Science,March16,2007)“谁先出现的呢，核酸还是蛋白质？”这个问题先前被看作是一个极难处理的矛盾，但随着核酶的发现，现在可以想象一个生命起源以前的‘RNA世界’，那里自我复制的酶执行两种功能。《科学》杂志期刊X射线衍射技术确定核酶晶体结构

TheStructuralBasisofRibozyme-CatalyzedRNAAssemblyMichaelP.RobertsonandWilliamG.Scott

Science16March2007:1549-1553.

ASYNTHETICRIBOZYMECATALYZESTHEBONDFORMATIONNECESSARYFORRNASYNTHESISBYTRANSITION-STATESTABILIZATIONANDACID-BASECATALYSIS,PERHAPS