基因组DNA变异的检测课件

人类疾病易感基因鉴定大赛系列讲座内容：一、生物实验室规范与微量移液器操作 （俞建瑛副教授）二、基因组DNA的提取和酶切 （李素霞副教授）三、PCR原理与技术 （吴海珍副教授）四、基因组DNA变异的检测 （欧阳立明副教授）人类疾病易感基因鉴定大赛

系列讲座之四

基因组DNA变异的检测Teacher:欧阳立明博士生物工程学院·应用生物学系2008.7奉贤Contentsp53基因与肿瘤个体基因组差异PCR-RFLP检测技术本实验整体流程4123什么是基因组？

基因组（Genome）——生物体全部的遗传物质；原核生物的基因组真核生物的基因组：细胞核；细胞器生物体——对基因组信息复制、传递、解码的复杂系统。人类基因组概况TheHumanGenomeProject(HGP)是代表性测序：24条染色体（22条常染色体+X+Y）；3×109碱基只有约3%DNA编码蛋白质约3~4万个基因人体基因组核型图个体基因组差异中的秘密为什么？为什么每个人相貌、性格、智力……都不一样？为什么有的人容易得病，有的人却对疾病的免疫能力特别高？为什么在药物的使用过程中，有的人一用就灵，有的人却不灵，甚至中毒？这些现象使人们认识到：必须从不同个体基因组序列的多态性上去阐明个体对疾病和药物反应上的多态性，才能真正了解与疾病特別是多基因疾病有关的遗传机制，同时深入了解人类起源、进化和迁徙过程中的DNA序列变化。基因组差异的主要表现SNP(Singlenucleotidepolymorphism)：单核苷酸多态性，基因组中数量最多的分子标记SSLP(Simplesequenceslengthpolymorphism)，简单序列长度多态性，也称微卫星(Microsatellite)Insertionanddeletion(Indel)：碱基的插入和缺失SNP的特点就好像单词的变体或者中文中的通假字在基因组中大量存在，已经报道了超过300万个SNP，估计整个人类中存在1500万个SNP一般为二等位性转换(transition,如A→G)高于颠换(transversion,如A→T)同一位点极少发生再次复制错误30%位于编码区，70%位于非编码区同源染色体、姐妹染色单体、等位位点一对同源染色体一对姐妹染色单体A,a：一对等位位点同源染色体、姐妹染色单体、等位位点同源染色体：是指形态、结构、遗传组成基本相同的染色体。对于同一个体来说，同源染色体对在减数第一次分裂前期中彼此联会(配对)，并且能够形成四分体，然后分裂到不同的生殖细胞的一对染色体，一个来自母方，另一个来自父方。姐妹染色单体：姐妹染色单体是由一个着丝点连着的并行的两条染色单体，是在细胞分裂的间期由同一条染色体经复制后形成的。等位位点：个体或群体同源染色体上相同的位置。四分体每个四分体都有2条染色体，2对姐妹染色单体，4个DNA分子。由于四分体时期同源染色体之间经常互相缠绕，再分开时不一定能维持染色体原来的形态和组成，有可能发生同源非姐妹染色体之间的交叉互换，这是染色单体上，也是不久之后染色体上基因重组的原因。

编码区的SNP与疾病或药物反应个体差异关系密切，是制药企业的金矿四种后果：同义Synonymous：

AAA(Lys)AAG(Lys)(silentmutation)无义non-sense：TGG(Trp)TGA(Stop)错义mis-sense：AGU(Ser)ATU(Ile)。一些单基因遗传病的病因。sicklecellanemia,hemoglobin146residue(GAG(Glu)GTG(Val)改变基因的表达SNP的演化过程如何检测SNP或突变酶法：根据酶对DNA序列的识别特异性限制性内切酶:RFLPDNA连接酶DNA聚合酶在合成时的校正功能：TaqMan®构象分离法：电泳检测DNA的构象变化单链构象多态性（SSCP）异源双链电泳迁移率变化dHPLCDNA杂交法：碱基变化对DNA互补配对杂交动力学的影响DASH,DNAchip,ASO斑点杂交等直接测序法焦磷酸测序（Pyrosequencing）单碱基延伸标签测序：(SingleBaseExtension,SBEtag)FluorescentDyeTerminator;Fluorescencepolarization;MS;MALDI-TOF基于杂交的RFLP提取基因组→酶切→特异性探针DNA杂交注意等位位点上SNP的杂合、纯合在检测结果上的差异！RFLP的特征可遗传给子代并符合孟德尔规律。基因组变异的数据库1)NCBI的遗传变异数据库（dbSNP）2)SNP研究联盟（TheSNPConsortium,TSC）提供的数据库：3)人类基因组突变数据库（theHumanGenomeVariation,HGVbase）

p53基因与肿瘤p53是一个抑癌基因，可诱导异常细胞进入凋亡。几乎所有的肿瘤和约50%的恶性肿瘤中都发现了p53基因的突变或缺失。突变的结果是90%导致翻译出的氨基酸发生改变，10%是不能形成P53蛋白。

Moredetailspleasereferto:P53蛋白的结构转录激活区脯氨酸富含区，与DNA损伤介导的细胞凋亡有关核心结构区(DNA结合区)，突变高发区，引起蛋白质构象变化。核定位信号（NLS），高度保守p53的突变位点统计人类肿瘤p53基因突变肿瘤类型突变频率（％）突变热点（密码子）肺癌56157，248，273结肠癌50175，245，248，273卵巢癌44273胰腺癌44273皮肤癌44248,278胃癌41不确定头颈部鳞癌37248膀胱癌24280前列腺癌30不确定肝细胞癌45249胶质瘤25175,248乳腺癌22175，248，273子宫内膜癌22248甲状腺癌13248，273白血病12175，248

食管癌45不确定PCR扩增区域图解Codon248cCGG(Arg)→cTGG(Trp)cCTG(Leu)cCAG(Gln)↓MspI248位密码子的突变类型预期电泳结果正常PCRGenome100bp200bp300bp500bpDNAMarkerFig.1PCR-RFLPresultofp53geneM1:Marker3(200,500,800…)bp;1:GenomeDNA2:PCRresultofexon7fragmentofp53geneM2:100bpladderDNAMarker3:Digestionresult200bp500bp800bpM112M23大赛实验流程（PCR-RFLP）1)个体基因组提取2)PCR获得p53基因第7外显子片段3)对PC