成果课件大三下seminar

SyntheticBiologyofAnti-infectiveActinobacteria:ComplexLifestyleandaRichSecondaryMetabolismPhylumandOrderfilamentous,Gram-positive,highG+CDNAaerobic,chemoheterotrophiccomplexlifecycle:mycelium,aerialhyphae,soil:saprophytic,nt-associated(rhizosphere,symbionts,endophytes,Proteasen:UbiquitäreEnzymemitverschiedenenFunktionen:Komplementsystem,bakterielleZellwandbildung,Toxine,Virulenzfaktoren,Gerinnungskaskade,Apoptose,Entwicklung,Stressreaktion1972vonStreptomycessviceusvonHanka&DietzisolierttabolitvonL-GlutaminHemmtEnzyme,dieL-Glutamyl-Substrateverwenden,Grund:ähnlicheTumorzellenkönnendieEnergiedurchdasMetabolismusvonGlutaminBioaktivitätantiproliferativewirksaminTiermodellen:Lymphozytenleukämie,LungenkarzinomklinischePhaseI&II:Brzst,Lunge,Eierstock,allewegenToxizität(ZNS,Blutbildungetc.)undbegrenzterpositiverWirkungenabgebrochendieBesonderheitvonStruktur:einIsoxazol-Fütterungsversuche:Acivicin-Biosynthese→Proteinexpressionund-Stabilität,KanamycinkannmitvielProteinverbinden,vielProteinsindwichtigfürBakterien),dieandereSeitewarummannichtAmpicillinbenutzt?BilligabernurdiekuzeWirkungenistwundbar,abernachkurzeZeit,Ampicillinfunktionieertnicht,dannkaputt.OD600:derAbsorptionswertbeiWellenlängeIPTG(Lac-operon:Isopropylß-DThiogalactoside):(Produkte)verbindenundandocken→ChelatbildnerundAdsorbens→eskanndurchBakteriennichtmetabolisiert→stabil正常情况下,细菌体内存在‘负反馈机制’,也就是子,加入IPTG后,IPTG和子表达的产物结合,使其对后续的表达不能产生抑制作用,从而达到持续产生产物的目的.Proteinexpressionat20°C,derGrundbestehtdarin:wennTemperaturhochist,danngibtesdieMöglichkeit,DNAfalschgefaltetwerden→normalunlöslichProblememitStreptomyces-andererunterschiedlichehoheverschiedeneDEstrainsarelysogensofbacteriophageλDE3:chromosomalcopyoftheT7RNApolymerasepLysSstrainscontainsmidwithT7lysozyme,anaturalinhibitorofT7RNApolymerasethatsuppressesbasalexpressionofT7RNApolymerasepriortoinductionOD-Messung(OD600=bei600EineMöglichkeitdasBakterienwachstumineinerKulturzuüberprüfen,istdieErmittlungderoptischenDichtederKulturübereinenbestimmtenZeitraum.DieoptischeDichtekannmiteinemPhotometergemessenwerden.LichtwirdvonverschiedenenStoffenadsorbiert.WirdeinLichtstrahleinerbestimmtenWellenlängedurcheineKüvettemiteinerLösung/einerSuspensiongeschickt,sokanneinTeildesLichtesdurchdasMedium/diePartikeladsorbiertwerden.DieIntensitätdesausfallendenLichtes(I1)istdanngeringer,alsdiedeseinfallendenLichtes(I0).DerZusammenhangzwischenderAdsorptiondesLichtesundderKonzentrationdesStoffeswirddurchdasLambert-Beer‘scheGesetzbeschrieben.Eszeigt,dassdieVerringerungderLichtmengeabhängigistDerMengederadsorbierendenSubstanzinderFlüssigkeitDemWeg,dendasLichtdurchdieFlüssigkeitzurücklegenDerWahrscheinlichkeitdassdasLichtdurchdieSubstanzadsorbiertwird(istabhängigvomAdsorptions-oderExtinktionskoeffizientderjeweiligenSubstanz).DerZellaufschlussbzw.dieLyseisteineüblicheTätigkeitdertäglichenProbenvorbereitunginBiotech-Labors.DasZielderLyseistes,TeilederZellwandoderdiekompletteZellezuzerstören,umbiologischeMolekülezuextrahieren.DassogenannteLysatbestehtz.B.aussmid,Rezeptoren-Assays,Proteinen,DNA,RNAetc.NachgelagerteSchrittedesZellaufschlussessinddieFraktionierung,dieIsolierungderOrganellenoder/unddieProteinextraktionund-aufreinigung.His-DieAminosäuresequenzdesPolyhistidin-TagsisteineFolgevonmindestenssechsHistidinen,derenGensequenzN-terminalnachdemStart-Methionin-CodonoderC-terminalvordasStopcodonindasoffeneLeserastereinesGenskloniertwird.[2]DadurchentstehteinFusionsproteinmiteinemPolyhistidin-Tag.GelegentlichwirdeineSchnittslefüreineProteaseodereinInteinzwischenProteinundPolyhistidin-Tageingefügt,umeineAbspaltungdesTagsnacheinerProteinreinigungzuermöglichen.ProteinpurificationwithNi-NTA(Nitrilotriaceticacid)affinityDasPolyhistidin-TagbindetmitmikromolarerAffinitätanzweiwertigeNickel-oderKobalt-IonenundbildeteinenChelatkomplex.WerdendieIonendurchBindunganeinenFeststoff-gekoppeltenChelatorimmobilisiert,könnendieProteinemitPolyhistidin-TagineinerAffinitätschromatographie(genauer:ineinerMetall-Chelat-Affinitätschromatographie)selektivgebundenwerdenunddurchSpülenderSäulemit20mMImidazolvondenungebundenenProteinenbefreitwerden.Polyhistidin-TagswerdenzurReinigungrekombinanterProteineperSDS(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelDieMigrationsgeschwindigkeitineinemelektrischenFeldhängtvonderDimension,FormundLadungderMoleküleab.FürdieDesaggregationundDenaturierungderProteinewerdenSDS,ß-Mercaptoethanoloder(Reduktionsmit)undWärmeSDS(starkanionischesDetergens)versorgtdieProteinemiteinernegativenLadung.MechanismusvonSDSIntegraleMembranproteinesindindieMembraneingebettetundkönnenausdiesernichtgelöstwerden,ohnedieMembranzuzerstören.Diesgeschiehtz.B.durchBehandlungmitDetergentienoderorganischenPeriphereMembranproteinebindenmeistnurandieLipid-KopfgruppenoderanandereintegraleMembranproteineundlassensichrelativleichtvonderMembranlösen,z.B.durchdurchhoheSalzkonzentrationen(1MNaCl)oderdurchVeränderungendespH-Wertes.EinigemembranassoziierteProteineenthaltenkovalentgebundene