实验四离子交换层析分离单核苷酸

实验四离子交换层析分离单核苷酸第1页，共17页，2023年，2月20日，星期六

目的要求

通过以强碱性离子交换树脂分离单核苷酸，学习和掌握离子交换层析的原理和操作方法。第2页，共17页，2023年，2月20日，星期六离子交换层析（IonExchangeChromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。离子交换层析的基本原理第3页，共17页，2023年，2月20日，星期六树脂－N+(CH3)—OH-离子交换层析的基本原理离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团）和反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；

纤维素－O—CH2—COO-—Na＋

基质电荷基团

反离子

第4页，共17页，2023年，2月20日，星期六RA+B＋RB＋A+(RA是阳离子交换剂，B为溶液中的离子或待分离的生物分子）离子交换层析的基本原理当[A+]=[B+],[RB]>[RA],说明R－与B＋的结合力比A＋大；反之亦然。对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及溶液的pH值。第5页，共17页，2023年，2月20日，星期六平衡装柱

离子交换剂带上反离子(R-O-X+)上样

样品（A＋,B+

，C+，等）与反离子（X＋）竞争与电荷基团结合；（结合力A＋>B+>Y+>C+>X＋）洗脱

洗脱液中的离子成分（Y＋）与样品(A＋等）竞争结合电荷基团，首先C洗下来，随着Y＋浓度增加，B＋洗脱出，最后A＋出来，使样品分离。

所以从上样到洗脱都是根据结合力的大小进行进行的。洗脱液的选择很重要，要使有效成分和杂质分离。离子交换层析的基本步骤第6页，共17页，2023年，2月20日，星期六离子交换层析的基本步骤第7页，共17页，2023年，2月20日，星期六1.单核苷酸的结构碱水解使核酸降解为2’或3’单核苷酸混合物，在2‘，或3’位带磷酸基团。离子交换层析分离单核苷酸的原理第8页，共17页，2023年，2月20日，星期六2.阴离子交换层析分离单核苷酸的依据单核苷酸为两性电解质，几种单核苷酸的等电点AMP2.65GMP2.35CMP4.5UMP1.55按等电点由高到低：CMP>AMP>GMP>UMP

但是由于树脂对嘌呤的吸附力大于对嘧啶的吸附，所以洗脱顺序是：CMP-AMP-UMP-GMP

如果以阴离子交换剂分离，洗脱顺序是：

CMP>AMP>GMP>UMP离子交换层析分离单核苷酸的原理第9页，共17页，2023年，2月20日，星期六3.2’，3‘单核苷酸等电点的差异由于2’和3’核苷酸的磷酸基团与碱环的距离不同，所以碱环上碱基基团的pK值有区别，所以2’和3’核苷酸的PI值有区别。2’核苷酸的PI值略高于3‘核苷酸的等电点。所以每种单核苷酸洗脱时出现2个峰。离子交换层析分离单核苷酸的原理第10页，共17页，2023年，2月20日，星期六4.离子交换剂的类型所用的离子交换剂为阴离子交换树脂，所带电荷基团为季铵基。树脂－N+(CH3)3－离子交换层析分离单核苷酸的原理第11页，共17页，2023年，2月20日，星期六离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤

1）样品的获得

以KOH37°C水解酵母RNA，生成2’－或3‘－核苷酸混合物。最终pH值调到8.0（注意核苷酸所带电荷！）。具体操作见讲义p23。2)交换剂的平衡和装柱

以甲酸钠溶液平衡，反离子为甲基（COO-）。具体步骤见讲义p23。3）加样

以滴管加入1.0ml样品，以3－4d/min

的速度让其进入层析柱。然后以200mlddH2O洗柱至OD260<0.02。第12页，共17页，2023年，2月20日，星期六离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤

4）洗脱并检测依次用以下溶液分段洗脱：250ml

0.02mol/L甲酸；

250ml

0.15mol/L甲酸；250ml0.01mol/L甲酸－－0.05mol/L甲酸钠溶液（pH4.44);250ml0.1mol/L甲酸－－0.1mol/L甲酸钠溶液（pH3.74);流速1ml/min。收集洗脱液，10ml一管分别进行紫外检测，并记录吸收值。第13页，共17页，2023年，2月20日，星期六离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤5)分析检测

a.根据记录的紫外吸收值，分别做出分步洗脱曲线(如图所示）。

第14页，共17页，2023年，2月20日，星期六离子交换层析分离单核苷酸的实验步骤b.保留各组分的洗脱高峰管，作出各组分在230－300nm波长范围内的紫外吸收光谱图（如图所示）。第15页，