微生物与基因工程

微生物与基因工程第1页，共43页，2023年，2月20日，星期六限制性内切酶的命名与分类分类：根据识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为：I、II、III三种类型命名：（1）属名的头一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示。如大肠杆菌Eco。（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型。EcoR.（3）如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。EcoR.I第2页，共43页，2023年，2月20日，星期六

由3个亚基组成，即有内切酶活性，又有甲基化酶活性；辅助因子，二价金属镁离子，ATP、SAM(S－腺苷甲硫氨酸)；他们的切割位点基本上是随机的，每1000～5000个核苷酸切割成约75个核苷酸缺口；基因工程中没有实际用处。限制性核酸内切酶的基本特性I型酶：第3页，共43页，2023年，2月20日，星期六有两个亚基（M和R）组成的蛋白质复合物，即有内切酶活性，又有甲基化酶活性，M亚基负责位点的识别与修饰，R亚基具有核酸酶的活性。辅助因子，二价金属镁离子，ATP、SAM(S－腺苷甲硫氨酸)。切割位点在识别序列之外，兼有切割和修饰双重作用。基因工程中没有实际用处。III型酶：第4页，共43页，2023年，2月20日，星期六一般，II型限制酶能识别由4～6个核苷酸组成的特定序列。大多数II型限制酶切割位点的一个显著特点是他们具有双重旋转对称的结构或回纹结构。II型限制酶切割DNA后，均产生含5ˊ磷酸基和3ˊ羟基的末端。5ˊ-GAATTC-3ˊ3ˊ-CTTAAG-5ˊ对称轴II型酶：第5页，共43页，2023年，2月20日，星期六II型酶的3个基本特点：（3）断裂结果形成的DNA片断形成具有互补的单链延伸末端。（1）是在DNA双链分子上有特异性识别并容易切割的序列部位，使被切割的DNA分子形成单链的断裂。(2)是在DNA分子上两个单链断裂部位通常不是彼此直接相对的。第6页，共43页，2023年，2月20日，星期六限制酶作用产生的DNA片断主要有两种形式：

（1）粘性末端：是指在限制酶作用下DNA分子形成的具有互补碱基的单链末端，它们能够通过互补碱基间的配对重新环化。5ˊ-GAATTC-3ˊ3ˊ-CTTAAG-5ˊ5ˊ-GAATTC-3ˊ3ˊ-CTTAAG-5ˊ（2）平末端：限制酶是在识别序列的对称轴上切割，DNA片段具有平末端。

第7页，共43页，2023年，2月20日，星期六影响核酸内切酶活性的因素同裂酶（isoschizomers）:有些来源不同的限制酶确识别和切割相同的序列。同尾酶（isocaudomers）:有些来源不同的限制酶,识别及切割序列各不相同，但却能产生相同的粘性末端。（1）DNA的纯度。（2）DNA的甲基化程度。（3）酶切消化反应的温度。（4）DNA的分子结构。（5）核酸内切酶的缓冲液。第8页，共43页，2023年，2月20日，星期六2、DNA连接酶连接方式：（1）用T4或E.coliDNA连接酶可连接具有互补粘性末端的DNA片断；（2）用T4DNA连接酶连接具有平末端的DNA片断；（3）先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再行连接。定义：是一种能够催化DNA中相邻的3ˊ－OH和5ˊ磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键并把两端DNA拼接起来的一种酶。主要有两种：T4DNA连接酶，分子量7500，粘性末端连接，NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为辅助因子；DNA连接酶，分子量6800，粘性末端连接和平末端连接，Mg2+，ATP作为辅助因子。第9页，共43页，2023年，2月20日，星期六3、DNA聚合酶主要功能:是参与DNA的修复过程。从大肠杆菌中纯化出来的DNA聚合酶有三种类型：DNA聚合酶I,DNA聚合酶II,DNA聚合酶III.其中只有DNA聚合酶I同DNA的分子克隆有密切的关系。DNA聚合酶I有三种不同的酶催化活性：5ˊ3ˊ的聚合酶活性；5ˊ3ˊ核酸外切酶活性；3ˊ5ˊ核酸外切酶活性；定义：指能够把脱氧核糖核苷酸按5ˊ3ˊ方向连续的加到双链DNA分子引物链的3ˊ－OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。第10页，共43页，2023年，2月20日，星期六DNA聚合酶I催化合成DNA必要条件：

（2）带有3ˊ－OH游离集团的引物链。（1）全部四种脱氧核苷5ˊ－三磷酸dNTPs和Mg2+离子。（3）DNA模板。第11页，共43页，2023年，2月20日，星期六4、DNA修饰酶碱性磷酸酶，催化磷酸分子脱掉5ˊ磷酸集团。5、逆转录酶DNA甲基化酶，转移甲基的；T4多核苷酸激酶，催化γ－磷酸从ATP分子转移给DNA分子；第12页，共43页，2023年，2月20日，星期六10.5外源基因导入宿主细胞一、外源基因与载体的体外连接DNA分子体外重组技术，主要依赖于核酸内切酶和DNA连接酶的作用。注意问题：

①实验步骤要尽可能简单易行。②连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片断。③对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。第13页，共43页，2023年，2月20日，星期六黏性末端连接法平末端DNA连接法接头或衔接物连接法均聚物加尾法第14页，共43页，2023年，2月20日，星期六二、克隆载体对宿主的基本要求(4)一般为缺陷型菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组。(1)能高效吸收外源DNA。(2)具有使外源DNA进行高效复制的酶系统。(3)不具有限制酶修饰系统，故不会使导入宿主细胞内DNA发生降解。(5)便于基因操作和筛选。(6)具有安全性(7)遗传稳定性高。(8)内源水解蛋白酶缺失或蛋白酶含量低。(9)在遗传密码的使用上无明显的偏好性。(10)具有较好的转移后加工机制。第15页，共43页，2023年，2月20日，星期六（1）、原核生物宿主4、为了便于阳性克隆的筛选，作为克隆宿主的基因型应与载体的基因形相对应。要求：1、根据克隆载体性质以及它们导入细胞的方式选择相应的宿主细胞。2、若选择噬菌体作为克隆载体，则应选择对噬菌体敏感的宿主作为克隆载体的宿主。3、若用M13衍生物作为克隆载体，则应选择含有F因子的雄性的大肠杆菌作为宿主。5、严格限制载体的宿主范围，以达到尽量避免重组体从实验室逃逸出去。第16页，共43页，2023年，2月20日，星期六大肠杆菌作为宿主的优缺点优点：1、遗传背景清楚。2、单细胞生物，材料一致性强。3、目标基因表达水平高。4、培养周期短。5、抗污染能力强。6、裸露的DNA，重组率高。缺点：1、条件致病菌。2、对真核基因缺乏有效的翻译后加工修饰功能。3、不具真核细胞的蛋白质折叠系统，细胞内蛋白质、酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定。第17页，共43页，2023年，2月20日，星期六（2）、真核生物宿主5、能将外源基因表达产物分泌致培养基中。1、基因表达调控机理比较清楚，酿酒酵母的全部基因测序已完成，并且遗传操作较为简单。2、具有原核细菌无法比拟的真核生物蛋白质翻译后修饰加工系统。3、不含有特异性病毒，不产生毒素，属于安全型基因工程。4、大规模发酵工艺简单，成本低廉。6、酵母菌是最简单的真核生物，利用酵母菌表达动植物基因能在相当大程度上，阐明高等真核生物及致人类基因表达调控的基本原理及基因密码。第18页，共43页，2023年，2月20日，星期六原核宿主与真核宿主的比较宿主:大肠杆菌目标蛋白表达形式:包涵体存在位置:细胞内特点:

1、对表达质粒结构要求简单。2、表达量高20％～40％。3、可表达宿主有毒或有致死效应的蛋白。4、避免细胞内蛋白水解的作用。5、需要溶解复性，有时不能完全复性，提高成本。第19页，共43页，2023年，2月20日，星期六宿主:酵母菌目标蛋白表达形式:可溶性蛋白存在位置:细胞内、外、周质空间特点:1、避免复性带来得问题。2、不能表达结构复杂的蛋白质，如不能形成二硫键。3、分离提纯过程复杂。第20页，共43页，2023年，2月20日，星期六（1）、外源DNA导入原核细胞

①重组DNA分子的转化或转染②

λ噬菌体的体外包装与感染

①外源DNA导入酵母细胞原生质体转化法；电击法（电穿孔法）

②外源DNA导入哺乳动物细胞微量注射法；电穿孔法；（2）、外源DNA导入真核细胞③外源DNA导入植物细胞微量注射法；电穿孔法；共培养法；基因枪法；三、外源基因导入宿主细胞第21页，共43页，2023年，2月20日，星期六四、目的克隆的筛选与鉴定抗生素抗性选择法如果外源的DNA片断插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有该抗生素的培养基的平板上进行培养，仍可长出菌落。此外，还有一些自身环化的载体和没被酶解的载体，他们的转化细胞也能在含抗生素平板上生长并形成菌落，而只有作为对照的受体细胞不能生长。此法缺点是假阳性高。1、载体选择标记的鉴定第22页，共43页，2023年，2月20日，星期六插入失活法插入表达法在某些载体的标记基因前面连接一段负控制序列，当外源DNA片断插入该负控制序列中，使负控制序列失活，因而位于下游的标记基因解除阻遏而得到表达。第23页，共43页，2023年，2月20日，星期六β－半乳糖苷酶显色反应

某些载体都携带有LacZ’基因一段序列，它编码β－半乳糖苷酶的a肽，而宿主细胞为LacZΔM15的突变株。将上述载体的转化细胞培养在含有X-gal和IPTG平板中，由于基因内互补作用，产生了有活性的β－半乳糖苷酶，把培养基中的无色X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5－溴－4氯－靛蓝，使菌落呈蓝色。

若将外源DNA插入到载体上LacZ’序列中，使a肽基因失活，失去a－互补作用，将重组转化细胞培养在含有X-gal-IPTG平板上，菌落无色。利用β－半乳糖苷酶显色反应即可挑出含有外源DNA重组体的阳性克隆。第24页，共43页，2023年，2月20日，星期六2、目的基因序列的鉴定

将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤维膜上。反转此滤膜并置于另一个不含菌的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。取出滤膜，用裂解液处理噬菌体裂解，释放出DNA。再用碱处理，使DNA变性，经烘烤将变性DNA固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交的菌落，即可筛选到阳性克隆。（1）菌落（或噬菌斑）原位杂交第25页，共43页，2023年，2月20日，星期六（2）内切酶图谱鉴定（4）DNA序列测定最后为确定目的基因的正确性，必需对重组的DNA进行序列测定。将初筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体DNA，用1～2种内切酶酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入DNA片段大小。（3）PCR鉴定通过与插入片段两侧互补的引物，以重组质粒DNA作为模板进行PCR分析，可快速检测出插入DNA片断大小。第26页，共43页，2023年，2月20日，星期六3、基因表达产物的鉴定如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异性抗体发生免疫反应。将平板上的克隆转移到滤膜上，处理滤膜使菌体裂解，释放出蛋白质，固定于滤膜上，加入标记抗体。如果抗体用放射性同位素标记，则免疫反应后进行自显影；若加入的抗体用酶偶联（酶标），那末此酶就可将无色底物水解成有色底物。（1）表达产物免疫活性测定第27页，共43页，2023年，2月20日，星期六（2）表达产物生物活性检查可根据表达产物的不同情况采用不同的方法检测其生物活性。若表达产物是一种酶，则可测定其酶活性；若所表达蛋白质是一种酶抑制剂，则可测定其抑制酶活性能力的大小。（3）表达产物氨基酸序列测定测定表达产物“N”端氨基酸序列，对表达产物的鉴定具有特别重要的意义。第28页，共43页，2023年，2月20日，星期六10.6外源基因在细菌中的表达真核细胞基因在原核细胞中表达时存在的问题（1）真核生物的启动子不能被原核细胞的RNA聚合酶所识别；（2）真核生物的mRNA上没有SD序列，因此不能被原核细胞核糖体结合；（3）真核生物的基因含有内含子，原核细胞缺乏将它们的转录物进行拼接加工的机制；（4）真核细胞的基因产物，往往需要翻译后加工，原核细胞缺乏有关的加工酶；（5）真核基因表达的蛋白质易被原核细胞蛋白酶所降解等等；第29页，共43页，2023年，2月20日，星期六原核细胞表达真核生物基因注意的问题（1）基因的编码区必需是连续的，因此要切除内含子的cDNA；（2）基因必须置于原核细胞启动子、终止子和SD序列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有效识别；（3）产生的mRNA必须相对稳定并能进行有效翻译和蛋白质折叠。第30页，共43页，2023年，2月20日，星期六一、外源基因的转录1、启动子（promoter）启动子（promoter）：是指RNA聚合酶结合于DNA并起始合成RNA的一段DNA控制序列。原核基因启动子位于转录起点上游，由两端彼此分开且又高度保守的核心序列组成。2、转录的调节和调控诱导物诱导温度诱导RNA聚合酶调节3、转录终止子是指一段基因或操纵子的3´端，具有终止转录功能的特定DNA序列。第31页，共43页，2023年，2月20日，星期六二、外源基因的翻译1、核糖体结合位点：在大肠杆菌中，核糖体结合位点包括起始密码子及位于起始密码子上游3～11bp处，3～9bp的序列。2、密码子的偏爱性：在原核生物细胞中，对应于tRNA丰富的密码子称为偏爱密码子，而对应与tRNA稀少的密码子称为稀有密码子。3、终止密码子：是指一端位于基因或操纵子的3’末端，具有转录终止功能的特定DNA序列。第32页，共43页，2023年，2月20日，星期六三、外源基因的表达产物

所谓非融合蛋白是指外源蛋白不与宿主蛋白融合，使其自身单独表达。1、非融合蛋白表达为了在原核细胞中表达非融合蛋白，可将带有起始密码子ATG的真核基因插入到合适的原核启动子和SD序列下游。经翻译和转录，就可在原核细胞中，表达出非融合蛋白。第33页，共43页，2023年，2月20日，星期六2、防止非融合蛋白降解的措施非融合蛋白表达的优点：能够直接产生天然的外源蛋白。缺点：易被宿主细胞内的蛋白酶降解。措施：一般采用包内蛋白酶含量很低的突变株，作为表达外源蛋白的宿主菌。第34页，共43页，2023年，2月20日，星期六3、外源蛋白的分泌表达和包涵体优点：（1）有利提高外源蛋白的表达水平和对产物的纯化。（2）可防止蛋白酶对外源蛋白的降解。（3）可避免外源蛋白对宿主细胞的毒害作用。缺点：（1）为了获得可溶性活性蛋白，必需进行变性和复性处理，不可避免复性带来的问题。（2）不能表达结构复杂的蛋白质。（3）分离提纯过程复杂第35页，共43页，2023年，2月20日，星期六四、融合蛋白的表达

所谓融合蛋白是指蛋白质的N端由宿主基因编码，C端由外源基因编码。1、融合蛋白的表达载体为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达载体中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致，翻译才不会产生移码突变。方法：构建一套表达载体，第一个载体有正常的阅读框架，第二个载体多了一对碱基，第三个载体多了二对碱基。选择上述三种载体之一并与外源基因连接，以保证外源DNA阅读框架的正确。第36页，共43页，2023年，2月20日，星期六2、表达融合蛋白的优点

（1）融合蛋白较易获得高效表达（2）融合蛋白在细胞内比较稳定（3）许多融合蛋白可作抗原。3、融合蛋白中目的蛋白的分离纯化（1）酶法；（2）化学法；第37页，共43页，2023年，2月20日，星期六10.7基因工程的应用与展望一、基因工程药物

基因工程药物包括：激素、酶及激活剂和抑制剂、细胞因子、抗原和抗体、反义核酸、干扰RNA和疫苗等。此外，还可利用重组DNA技术改造蛋白质，设计和生产出自然界不存在的新型蛋白质药物。重组疫苗是目前最普遍使用的基因工程药物。重组胰岛素：目前已能在细菌中克隆人胰岛素基因并用于大规模生产。重组疫苗：利用重组DNA技术，克隆并表达抗原基因的编码序列，并将表达产物用作疫苗。第38页，共43页，2023年，2月20日，星期六二、基因工程在农业上的应用转基因植物：包括抗病虫害、抗碱、抗冻、抗除草剂、缩短生产周期和延长水果蔬菜的储藏期