中药致癌作用

第七章中药致癌作用ChemicalCarcinogenesis第一页，共五十七页。癌症是遗传因素和环境因素交互作用的结果1775年英国Pott报告扫烟囱工人阴囊癌高发，提出与煤烟尘有关；1895年德国Rehn报告染料工人职业性膀胱癌，疑是化学物质引起；1915年日本山极和市川用煤焦油成功诱发实验性皮肤癌；1922年英国Kennway从煤焦油中分离出多种多环芳烃，其中几种可诱发动物皮肤癌，证实了化学物的致癌性；1945年英国Caes对染料工业膀胱癌流行病学调查，证实β–萘胺及联苯胺的致癌性。1970年，国际癌症研究所：80~90%的人类癌症和环境因素有关，其中主要是化学因素，约占90%以上。第二页，共五十七页。第三页，共五十七页。化学致癌作用(chemicalcarcinogenesis指化学物质引起并诱导正常细胞发生恶性转化并发展成为肿瘤的过程。化学致癌物(chemicalcarcinogen)具有致癌作用的化学物质。前致癌物(pro-carcinogen)间接致癌物(indirect-carcinogen)近致癌物(proximatecarcinogen)终致癌物(ultimatecarcinogen第四页，共五十七页。第一节化学致癌过程正常细胞经过遗传学改变的积累，才能转变为癌细胞，癌症的发生是多阶段过程，包括：引发阶段(initiation)促长阶段(promotion)进展阶段(progression)第五页，共五十七页。一、引发阶段概念：化学物或其活性代谢物与DNA作用，导致体细胞突变的过程。引发剂(initiator)：大多数是致突变物，没有可检测的阈剂量。引发作用靶点：原癌基因和肿瘤抑制基因引发细胞(initiatedcell)引发时间短，是一个突变事件，需经过细胞分裂来“固定”引发是不可逆遗传性改变，表型可能正常，无自主生长性----非肿瘤细胞并非所有引发细胞均将形成肿瘤，大多数细胞将凋亡。第六页，共五十七页。二、促长阶段概念：引发细胞增殖成为癌前病变或良性肿瘤的过程。促长剂(promoter)：具有促长作用的化学物。促长剂性质：非突变剂，有量效关系、阈剂量和最大作用。通常能引起局部增殖并引起良性肿瘤，少数细胞可成恶性肿瘤。促长阶段特点：时间长，早期可逆，晚期不可逆。对生理因素调节敏感(特别是早期)，衰老、激素和饮食可影响促长作用。对开展肿瘤预防有重要意义促长作用机制复杂，可通过改变基因表达起作用。第七页，共五十七页。促长剂：佛波酯(TPA，巴豆油活性成分)—小鼠皮肤癌糖精----膀胱癌四氯二苯并对二恶英(TCDD)---大鼠肝癌、肺、皮肤肿瘤性激素—作用器官、肝脏肿瘤

证实引发和促长作用实验：

周期：3-6个月终点：癌前损害(PNL)--小鼠皮肤乳头瘤、大鼠和小鼠肝转化灶等第八页，共五十七页。三、进展阶段概念：从癌前病变或良性肿瘤转变成恶性肿瘤的过程恶性生物学特征：自主性和异质性增加、生长加速、侵袭性加强、出现浸润和转移。出现恶性特征原因：--核型不稳定性(染色体不稳定性)：染色体发生断裂、断片易位及非整倍体变化。微卫星不稳定性(micosatelliteinstability，MSI)--不稳定性生物学标志：第九页，共五十七页。进展剂(progressor)：使细胞由促长阶段进入进展期的化学物。--砷酸盐、石棉纤维、苯、羟基脲等完全致癌物(compelet

carcinogen)同时具有引发、促长及进展阶段作用的致癌物。(黄曲毒素)第十页，共五十七页。综上所述----

化学物致癌是长期的、复杂的多阶段过程，至少涉及引发、促长和进展三个阶段。在引发和进展阶段主要是遗传机制，在促长阶段主要是表遗传机制。在引发阶段主要是细胞原癌基因和肿瘤抑制基因的突变，在进展阶段主要是核型不稳定。正常细胞经过遗传学改变的积累才转变为癌细胞。第十一页，共五十七页。遗传机制学说(genetictheory)：外来致癌因素引起细胞基因的改变或外来基因整合到细胞基因中，导致癌变。表遗传机制学说(epigenetictheory)：癌症的发生是由于非基因改变机制引起的化学致癌机制学说：亲电子剂学说、体细胞突变学说、癌基因学说、癌变多阶段学说第二节化学致癌机制第十二页，共五十七页。体细胞突变学说突变与癌症：1)很多致癌物是致突变物2)对某些致癌物的易感性取决于细胞代谢活化酶转化致癌物成为致突变物的活力3)DNA修复能力的缺失增加癌发生的可能性4)在多种癌观察到染色体和基因组的不稳定性5)某些癌有突变的癌基因6)癌的单克隆性7)某些癌具有可遗传性8)某些癌有肿瘤抑制基因的丢失或突变第十三页，共五十七页。癌基因与肿瘤抑制基因癌基因(oncogene)：一类能引起细胞恶性转化及癌变的基因。通常以原癌基因(pro-oncogene)形式普遍存在于正常基因组内。在进化过程中高度保守，具有正常的生物学功能，对细胞增殖、分化和信息传递的调控起重要作用。只有当受到各种致癌因素作用而激活变为活化的癌基因或过度表达后才显示其致癌性。如ras基因家族肿瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)：抑癌基因或抗癌基因。作用方式与癌基因相反，在正常细胞中抑制增殖和促进分化。在致癌因素作用下，肿瘤抑制基因突变或失活而引起细胞的恶性转化。如p53第十四页，共五十七页。非突变致癌机制化学物通过不涉及基因结构(DNA序列)的改变，使基因外的一些变化，影响基因的调控，使基因出现不正常关闭和开放，进而影响细胞的增殖，引癌变。表遗传学(epigenetics)研究从基因演绎为表型的过程和机制的一门遗传学分支学科。(在基因的DNA序列没有发生改变的情况下,基因功能发生了可遗传的变化,并最终导致了表型的变化。)

第十五页，共五十七页。1、表观遗传调控失常导致肿瘤发生2、细胞异常增生3、免疫抑制4、内分泌激素失衡5、过氧化酶体增殖剂激活受体第十六页，共五十七页。第三节、化学致癌物分类(作用机制)遗传毒性致癌物(genotoxiccarcinogens)非遗传毒性致癌物(non-genotoxiccarcinogens)表(观)遗传致癌物(epigeneticcarcinogens)第十七页，共五十七页。1、遗传性致癌物概念：进入细胞后作用于遗传物质(主要是DNA)，通过引起细胞遗传物质的改变，导致癌变的化学物

---可利用遗传毒理学试验来检测(1)直接致癌物(directcarcinogen)：无需体内代谢活化即可致癌。

大多数为亲电子剂，可与细胞大分子亲核中心发生共价结合。如：烷基和芳香基环氧化物、内酯、硫酸酯、亚硝酰胺等第十八页，共五十七页。(2)、间接致癌物(indirectcarcinogen)：需体内代谢，活化代谢产物致癌。前致癌物(precarcinogen)近致癌物(proximatecarcinogen)：代谢后先转变为化学性质活泼但寿命短暂的中间形式终致癌物(ultimatecarcinogen产物为亲电子剂，一些可能有多种代谢产物如：多环芳烃类化合物、芳香胺类、亚硝胺类、偶氮化合物、硝基杂环类、黄曲毒素B1等第十九页，共五十七页。(3)、无机致癌物：有些可能是亲电子剂，但可通过选择性改变DNA复制保真性，导致DNA改变

如：金属镍、铬、钛、镉或它们的盐类等有些无机元素由于放射性致癌

如：氡、铀、钋、镭等第二十页，共五十七页。2、非遗传性致癌物概念：不作用于机体遗传物质的化学致癌物

可能间接影响DNA并改变基因组导致细胞癌变，通过促进有丝分裂和抑制凋亡导致癌的发展。(1)、促长剂：本身无致癌性在给以遗传毒性致癌物之后再给予促长剂可增强遗传毒性致癌物的致癌作用；可促进“自发性”转化细胞发展成癌。如：佛波酯(TPA及其衍生物)—小鼠皮肤癌(已知活性最高)色氨酸、糖精----膀胱癌二恶英(TCDD)、DDT、氯丹、苯巴比妥---肝癌丁基羟甲苯(BHT)—肺肿瘤、肝细胞腺瘤、膀胱癌第二十一页，共五十七页。(2)、激素调控(内分泌调控)：主要改变内分泌系统平衡及细胞正常分化，常起促长剂作用如：雌、雄激素、类固醇雌二醇、已烯雌酚---人、动物肿瘤已烯雌酚---经胎盘致癌与化学致癌物同时或稍后接触睾酮或合成激素---前列腺癌或其他性器官肿瘤抑制甲状腺激素合成或分泌物质—甲状腺瘤长期在剂量使用抗甲状腺物质如硫脲、某些磺胺类药物---肿瘤第二十二页，共五十七页。(3)、细胞毒剂：可引起细胞死亡，导致细胞增殖活跃及癌发展如：氮川三乙酸---大鼠肾癌、膀胱癌氯仿等第二十三页，共五十七页。(4)、过氧化物酶体增殖剂：导致细胞内氧自由基过量生成过氧化物酶体增殖剂(peroxisomeproliferator)：可引起肝脏过氧化物酶体增殖的化合物。如：降血脂药：氯贝丁酯(安妥明)增塑剂：邻苯二甲酸乙基已酯第二十四页，共五十七页。(5)、免疫抑制剂：主要对病毒诱导的恶化转化起增强作用如：嘌呤同类物(咪唑嘌呤、巯嘌呤)—人或动物白血病或淋巴瘤(6)、固态物质：物理状态是关键性因素如：一些惰性物质(塑料)或金属薄片---啮齿类动物体内的种植部位引发肉瘤(物理特性、表面积决定致癌能力)石棉纤维—恶性间皮瘤或呼吸系统肿瘤(石棉的晶体结构，与组分无关)第二十五页，共五十七页。3、未分类如：二噁烷、美舍吡伦、乙醇、丙烯腈等第二十六页，共五十七页。助癌物Cocarcinogen：本身或单独接触无致癌性，在致癌物之前或同时接触可增加肿瘤的发生的一类化合物。本身既不具引发作用，也不具促长作用，但可促进引发作用和增强促长作用，即促进或增强全部致癌过程如：芘：苯并(a)芘---皮肤肿瘤香烟雾中儿茶酚、其他酚类---促长剂、助癌物第二十七页，共五十七页。第四节中药致癌物的评定主要根据：人群流行病学调查：可信度取决于严密的设计，研究过程受许多因素限制和干扰动物试验结果：花费大，周期长，动物使用数量大第二十八页，共五十七页。一般评定分析流程：化学物构效关系分析：利用定量构效关系(QSAR)，从有害物质的化学结构特点来评估受试物潜在的致癌危险性短期试验：致突变组合试验、细胞恶性转化试验、哺乳动物短期致癌试验等

进行初步筛查，若结果阳性再进行下一步试验哺乳动物长期致癌试验：经典、标准致癌性检测方法第二十九页，共五十七页。一、短期试验

(一)致突变试验优点：方法简单、快速、费用低、无需特殊检测仪器缺点：需要组合试验，无法检出非遗传毒性致癌物(阳性：遗传毒性致癌物or遗传毒性非致癌物阴性：非遗传毒性非致癌物or非遗传毒性致癌物)要求：灵敏度(sensitivity)--阳性符合率(呈阳性的比例)特异性(specificity)--阴性符合率(呈阴性的比例)第三十页，共五十七页。①基因突变试验：鼠伤寒沙门菌回复突变试验(Ames试验)、培养哺乳动物细胞TK或HGPRT正向突变试验；②染色体畸变试验：体外细胞系细胞遗传学试验、小鼠骨髓微核试验、大鼠骨髓染色体畸变试验；③原发性DNA损伤：DNA加合物、链断裂、慧星试验、DNA修复诱导(细菌SOS反应，大鼠肝UDS诱导)、SCE试验；④体外细胞转化：叙利亚地鼠胚胎细胞第三十一页，共五十七页。(二)细胞恶性转化试验

(cellmalignanttransformationassay)概论：外源因素对体外培养的细胞所诱发的恶性表型改变，包括细胞形态、细胞增殖速度、生长特性、软体畸变等变化，当细胞接种在裸鼠皮下可形成肉眼可见的肿瘤。

即培养细胞在有害因素作用下发生一系列与肿瘤形成有关的细胞形态学及生物学特性的改变。

体外细胞转化是一个多阶段的过程，具有体内致癌过程的某些特点，最终产生在形态学、生长方式、生物化学上发生改变的细胞克隆。第三十二页，共五十七页。例：成纤维细胞体外转化的表型改变：在等基因宿主或裸鼠体内形成肿瘤；细胞估计寿命无限长(永生化)；核型改变；细胞形态改变；生长杂乱；失去锚基依赖性生长特性，可在软琼脂中形成集落；能在低血清培养液生长；丢失某些表面蛋白；具有纤维蛋白溶解活性；表面微绒毛增加；-------------第三十三页，共五十七页。观察终点：细胞恶变(遗传学终点之一)确定恶性转化的可靠指标：在敏感宿主中的成瘤性。通常是接种于免疫抑制动物半固体培养基中成杂乱生长、形成集落及细胞交叉重叠常用细胞株(系)：金黄地鼠胚胎细胞(GHE)、叙利亚地鼠胚胎细胞(SHE)、中国地鼠肺细胞(CHL，V79)、BALB∕C-3T3发展趋势：动物原代细胞培养系统(SHE)非整倍体细胞系

人体上皮细胞(人类癌症70%源于此)第三十四页，共五十七页。细胞选择的主要原则：①体外容易培养和传代，阴性细胞克隆背景较低；②细胞自发突变率低或自发转化能力很弱，动物裸鼠试验呈阴性；③已获无限生长能力，但仍保持接触抑制而无致瘤性的细胞系(如病毒感染的永生化细胞：大鼠RLV∕RE细胞和仓鼠SA7∕SHE细胞)；第三十五页，共五十七页。细胞恶性转化试验评价：1、体外转化试验的终点仍属形态转化或恶性前期转化。此种转化可能发展为真正肿瘤，也可能停滞在此阶段，不进一步恶化。因此阳性结果的解释应慎重，仅提示受试物有致癌可能性。2、观察终点是细胞恶变，因此既可筛查遗传毒性毒物，也可检测非遗传毒性毒物。3、体外试验不能代替体内试验。4、通常测试细胞中代谢酶活性低下，降低了系统对间接致癌物的检测敏感性。第三十六页，共五十七页。(三)哺乳动物短期致癌试验有限体内致癌试验(limitedcarcinogenicitytest)有限动物试验(limitedinvivobioassay)

时间有限(数月)，靶器官有限原理：某些受试物对某些特定组织的致瘤作用，比其它组织更为明显。(观察特点靶器官的肿瘤发生情况)观察终点：不是病理确认的恶性肿瘤，而是以癌前病变如腺瘤、瘤性增生结节为主(周期短)第三十七页，共五十七页。常用试验：1、小鼠皮肤肿瘤诱发试验

小鼠连续涂抹受试物，以观察皮肤乳头瘤和癌的发生，一般20周。敏感小鼠为SENCAR小鼠。

可用于检测引发活性(多环芳烃)或促长活性(TPA(佛波醇酯))2、小鼠肺瘤诱发试验

染毒途径常用腹腔注射，也可灌胃或吸入，一般30周，观察肺肿瘤的发生。敏感小鼠为A系小鼠。可用于检测引发活性(乌拉坦)或促长活性(BHT(二丁基羟基甲苯))第三十八页，共五十七页。3、大鼠肝转化灶诱发试验

大鼠肝进行大部分切除后，给予受试物。一般8~14周，观察肝转化灶生成。肝转化灶是癌前病变，有γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-GT)活性升高，G6P酶和ATP酶活性降低，以及摄铁能力下降。典型引发剂为二乙基亚硝胺(DEN)。转化灶可用组织化学或免疫化学方法鉴定。可用于检测引发活性(二乙基亚硝胺DEN)或促长活性(苯巴比妥PB)4、雌性大鼠乳腺癌诱发试验一般可用SD大鼠(或Wistar)，周期6个月。第三十九页，共五十七页。方法学评价：1、此四个试验不是成组试验，应根据受试物特点选择使用；2、阳性结果与长期动物致癌试验相似；3、由于仅观察特定器官，试验周期短，阴性结果不能排除受试物致癌性；4、肝和肺是最常发生肿瘤的器官，也是众多致癌物的靶器官，所以多数试验选用小鼠肺肿瘤诱发试验和大鼠肝转化灶试验。第四十页，共五十七页。(四)转基因动物致癌检测模型优点：研究致癌过程特定基因的作用；快速检测方法：1、转癌基因小鼠：提高动物对化学致癌物的敏感度2、肿瘤抑制基因敲除小鼠：评价：标准化等不完善第四十一页，共五十七页。二、哺乳动物致癌试验

(long-termcarcinogenicitystudy)鉴定化学致癌物的标准体内试验试验目的：确定受试物对试验动物的致癌性、剂量-反应关系及诱发肿瘤的靶器官需要进行致癌试验的一般原则：1、人体可能长期暴露于该化学物2、该化学物或其代谢产物的化学结构与已知致癌物相似3、反复染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变第四十二页，共五十七页。ICH：需进行致癌性试验的新药1、持续用药6个月以上的药品2、过去的数据显示此类别的药品可能致癌3、药品的作用机制推测可能有致癌性者4、重复剂量毒性的试验结果显示有肿瘤生成现象的药品5、药品的成分或其代谢产物长期停留在组织中，产生局部的组织作用或病理生理反应6、基因毒性试验结果显示有致突变性等拟用于病人预期寿命少于3年的药品不必进行致癌试验，如肿瘤治疗药；若药物或制剂只针对有限的特定疾病或患者进行治疗，疗效确切、稳定时，可视在药物获准上市后的需要进行致癌试验第四十三页，共五十七页。ICH：致癌试验基本原则(新药)基本程序：一个长期啮齿类致癌试验，另一个进一步的体内试验(补充长期试验不易得到的信息)1、选择合适的物种根据：药理、代谢、毒理、毒物动力学、给药途径等。缺乏明显优先证据时，推荐选择大鼠短期、长期、遗传或其它资料表明对人致癌，通常不进行第二个试验2、进一步的致癌性体内试验(1)短期或中期体内啮齿类试验系统：引发-促长模型，如大鼠肝转化灶促长试验，多器官促长试验(用5种引发剂后再染毒性数月)；转基因小鼠试验；新生啮齿类致癌模型。(2)第二种啮齿类长期致癌试验3、选择中、短期致癌试验的考虑：试验方案的合理性、方案的优缺点和分析4、机制研究：结果解释和对人的危害性评价5、致癌强度评价：肿瘤发生率、潜伏期、啮齿类和人动力学比较及其它附加资料第四十四页，共五十七页。(一)、试验动物物种和品系：要求用两种实验动物，常规选用大鼠和小鼠，也可用仓鼠。(啮齿类因对多数致癌物易感性高，寿命相对较短，费用较低，生理和病理学资料较完备，而广泛使用。)选择品系要求较敏感、自发肿瘤率低、生命力强及寿命较长的品系。美国NCI(NationalCancerInstitute)推荐：Fischer344大鼠和B6C3F1小鼠第四十五页，共五十七页。性别：同等数量的雌雄两种性别动物，即雌雄各半年龄：刚离乳动物(保证足够长的染毒和发生癌症时间，且幼年解毒及免疫系统未完善，对致癌作用敏感)数量：满足统计学分析的要求

一般每组至少雌雄各50只，希望在出现第一个肿瘤时，每组还有不少于25只动物。动物数量需求数与实验动物肿瘤自发率、受试物诱发肿瘤发生率有关。如有两种以上受试物同时试验，可共用对照组，数量为雌雄各50×√受试物数第四十六页，共五十七页。(二)剂量设置一般原则：设3~5个剂量组、阴性对照组，必要时设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试物结构相近高剂量组：尽可能大，可引起轻微的毒性反应，但不影响正常生长、发育和生命。美国NCI推荐以最大耐受量(MTD)为高剂量，MTD由90天毒性试验确定，此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10%，并且不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤。ICH(1995)：①毒性终点；即MTD；②药代动力学终点，啮齿动物血浆AUC为人的25倍；③选择吸收饱和剂量；④药效学终点，不应产生生理学和内稳态紊乱；⑤最大可行剂量，饲料中最高含量为5%，限制剂量为1500mg∕kg∕天。第四十七页，共五十七页。中及低剂量组：按等比级数下推，如分别为上一个剂量水平的1∕2或1∕3。低剂量组不产生任何毒性，但应高于人的接触剂量，一般不低于高剂量的10%。中剂量组介于高、低剂量之间，如有可能按受试物的毒物代谢动力学性质来确定。第四十八页，共五十七页。(三)染毒方式原则：根据受试物理化性质和接触方式，尽可能模拟人体可能暴露途径，主要有经口、经皮和吸入三种。经口染毒：一般将受试物掺入饲料或饮水中连续给予(5~7天∕周)。若掺入后适口性不良，可用灌胃法。掺入浓度要定期监测，观察均匀性和稳定性，掺入浓度一般不超过5%。经皮染毒：涂敷受试物的面积一般不少于动物体表总面积的10%。必须保证良好接触，并防止动物舔食。每天涂抹一次，每周3~7次。吸入染毒：每天染毒4小时，每周5~7天。染毒柜内受试物浓度定期监测，其分布应均匀、恒定。第四十九页，共五十七页。(四)试验期限ICH(1995)建议参考准则：1、一般情况下，小鼠和仓鼠为18个月，大鼠24个月；对于某些生命期较长或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可持续24个月，大鼠30个月。2、当最低剂量组或对照组存活动物只有25%时，也可结束试验;对于有明显性别差异的试验，结束时间对不同的性别应有所不同;在某些情况下因明显的毒性作用，只造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验。3、合格的阴性对照试验标准：因饲养或管理问题所造成的动物损失在任何一组都不能高于10%，小鼠和仓鼠在18个月，大鼠在24个月时各组存活的动物不少能于50%。第五十页，共五十七页。(五)观察指标1、一般观察：每天观察动物的一般状况和毒性反应，对死亡动物及时剖检。试验最初三个月每周称体重一次，以后每(2)4周称体重一次。掺入饲料或饮水中染毒时，应记录食物消耗量或饮水量。2、肿瘤发生情况：对每一肉眼可见及或触及的肿瘤，均应记录其出现时间、部位、大小、外形、发展状况和动物死亡时间。3、病理检查：试验过程中死亡或濒死而提前处理动物，及试验结束后的全部处死动物均应进行系统尸检和组织病理学检查，确定肿瘤的性质和靶器官。对已经出现肿瘤或可疑肿瘤的器官和肉眼检查有明显病变的器官，应注意癌前病变。第五十一页，共五十七页。(六)结果分析统计各种肿瘤的数量(包括良性和恶性)及任何少见的肿瘤、患肿瘤的动物数、每只动物的肿瘤数及肿瘤潜伏期。1、肿瘤发生率(%)：=(实验