第二代测序数据分析原理

第二代测序数据分析原理第1页/共71页第二代测序数据分析原理徐汪节第2页/共71页2023/4/223三代DNA测序技术之比较第一代测序技术：Sanger测序法第二代测序技术：454测序……

第三代测序技术：？直接测序法：？第3页/共71页2023/4/224第一代测序技术：

Sanger测序法

——简便、快速第4页/共71页2023/4/225逐渐被遗忘的测序技术：

Maxam-Gilbert的DNA化学降解法

第5页/共71页2023/4/226Sanger测序的局限通过几十年的改进，第1代测序仪的读长可以超过1000bp，原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的成本是0.5美元,每天的数据通量可以达到60万碱基。但是，不管怎么改进，第1代测序技术在速度和成本方面都已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖,使其难以进一步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化降低测序成本）。在此种情况下，第二代测序技术（Next-generationsequencing)应运而生。第6页/共71页概要主要的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择第7页/共71页2023/4/228第二代测序技术454测序IlluminaSOLIDPolonatorCompleteGenomics……第8页/共71页2023/4/229454第9页/共71页2023/4/2210SOLID第10页/共71页2023/4/2211Illumina第11页/共71页2023/4/2212其他PolonatorCompleteGenomics……第12页/共71页2023/4/2213第13页/共71页2023/4/2214第二代测序技术的共同点1将目标DNA剪切为小片段2单个小片段DNA分子结合到固相表面3单分子独立扩增4每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号5高分辨率的成像系统。第14页/共71页2023/4/2215第二代测序技术的局限与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基的序列不足为奇。但是,除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成的。而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。第15页/共71页2023/4/2216第三代测序技术：单分子测序HelicosBiosciencesVisiGenPacificBiosciencesMobiousNexusI……第16页/共71页2023/4/2217第17页/共71页2023/4/2218直接测序法在所有上述三代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的。除了需要昂贵的光学监测系统，还要记录、存储并分析大量的光学图像，这都使仪器的复杂性和成本增加。依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNAElectronics，IBM,NabSys，OxfordNanoporeTechnologies，Sequenom等都在进行纳米孔测序的开发，不同的只是采用的方法或策略。第18页/共71页2023/4/2219第19页/共71页2023/4/2220第20页/共71页SecondgenerationsequenceRoche454MetagenomicsDenovosequencingRNA-seqillumiaSolexaDenovosequencingRe-sequencingRNA-seq(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)Meth-seqABISOLiDRe-sequencingChIP-seq

RNA-seq第21页/共71页ExperimentsDNA-seq:denovo,resequencingRNA-seq:mRNA,ncRNA,smRNA...ChIP-seq:ChromatinImmunoPrecipitationMethyl-seq:methylatedDNA(epigenome)第22页/共71页主要的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择第23页/共71页SequencingGlossaryReads.Acollectionofclonesthatover-samplethetargetgenome.Pair-endreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofasequencing-libraryclone.Mate-pairreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofamate-pairlibraryclonewhichinsertsizeisusually>1kb.Insertsize.Thesizeoftheclone-insertfromwhichaclone-endpairistaken.Contig.Theresultofjoininganoverlappingcollectionofsequencereads.Scaffold.Theresultofconnectiingnon-overlappingcontigesbyusingpir-endreads.N50size.Asappliedtocontigsorscaffolds,thatsizeabovewhich50%odtheassembled第24页/共71页第25页/共71页第26页/共71页第27页/共71页 全基因组denove分析工具PlatformCorrectionAssemblySolexaSOAPdenovoSOAPdenovoVelvet,AbyssSolidSAETVelvet454newbler第28页/共71页分析所需工具Bowtiesoftware-/index.shtml/SAMtools-/TopHatsoftare-/Cufflinkssoftware-http://C/CummeRbundsoftware-/cummeRbund/第29页/共71页外显子组分析工具PlatformAlignmentFindVariationsSolexaSOAP,bwaSOAPsnpsamtoolsSolidBioscope,BFASTBioscope,BFAST454BLAST,NEWBLERnewbler第30页/共71页主要的测序平台基因组分析原理转录组分析原理分析策略的选择第31页/共71页常规分析TranscriptsquantificationSplicingsitesdiscoveryandquantificationGenediscoverySNP/INDELdetectionAllelespecificexpression第32页/共71页第33页/共71页第34页/共71页第35页/共71页UniGene拼接目的：将预处理后reads进行拼接，得到拼接结果。

原理：应用deBruijngraphpath算法对reads进行denovo拼接；对上一步的拼接结果，再用HamiltonPath算法拼接。

结果：UniGene序列，UniGene统计信息，序列长度分布图第36页/共71页第37页/共71页3.数据库注释目的：对拼接得到的UniGene进行功能注释

原理：通过blast+算法将拼接得到的UniGene序列与数据库进行比对

结果：比对结果表格，物种分布统计和Evalue分布统计

第38页/共71页第39页/共71页UniGene表达分析目的：UniGene定量分析。

原理：以UniGene为reference，分别将每个样本的reads进行referencemapping,从而得到每个样本在每个UniGenes中的一个reads覆盖度，然后应用RPKM/FPKM标准化公式对富集片段的数量进行归一化。

RPKM：ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads，公式下:第40页/共71页UniGene表达分布图，1X，5X分别为FPKM=1，FPKM=5分界点，可以大体观察到低表达，中表达以及高表达的比例关系第41页/共71页UniGene样本间表达相关性散点图第42页/共71页样本间表达差异程度的MA图，可以体现差异表达总体偏差第43页/共71页UniGene表达差异分析目的：对定量结果进行统计检验分析，找出差异表达UniGene

原理：双层过滤筛选差异基因

FC值筛选：采用Fold-change(FC)，表达差异倍数进行第一层此的差异基因筛选

FDR检验：一般采用卡方检验中的fisher精确检验进行p值检验，采用BenjaminiFDR(Falsediscoveryratio)校验方法对p值进行假阳性检验，即，通过FDR显著性参数进行第二层次的差异基因筛选。

第44页/共71页组间差异基因上调与下调个数统计，可以通过此图观察上调与下调的一个总体趋势第45页/共71页差异基因火山图，可以观察到差异基因总体分布第46页/共71页GO功能分类

目的：利用数据库注释信息将UniGene进行GO功能分类。

原理：利用数据库的注释结果，应用blast2GO算法进行GO功能分类，得到所有序列在GeneOntology的三大类：molecularfunction,cellularcomponent,biologicalprocess的各个层次所占数目，一般取到14层。

结果：MF，BP，CC三大分类结果文件以及UniGene2GO关系列表，三大类别中第二层次上的柱状分布图和饼图，GO功能的层次分布图。

第47页/共71页第48页/共71页第49页/共71页第50页/共71页第51页/共71页KEGG代谢通路分析目的：对拼接得到UniGene进行KEGGpathway映射。

原理：应用KEGGKAAS在线pathway比对分析工具对拼接得到的UniGene进行KEGG映射分析。

结果：标记的Pathway通路图。第52页/共71页第53页/共71页IPApathwayanalysis

(/)第54页/共71页COG注释目的：对拼接得到UniGene进行COG功能分类。

原理：利用blast+算法将拼接得到的UniGene与CDD库中的COG/KOG库进行比对，进行COG功能分类预测，将其映射到COG分类中。

结果：COG分类分布情况图。第55页/共71页第56页/共71页SSR重复序列注释目的：对拼接得到UniGene进行SSR简单重复序列的查找。

原理：筛选标准：单核苷酸重复的次数在10次或10次以上，二核苷酸重复的次数在6次或6次以上，三至六核苷酸重复的次数在5次或5次以上。同时，也筛选中间被少数碱基(间隔小于100或等于100)打断的不完全重复的SSR。

结果：重复序列的信息文件以及统计文件。

第57页/共71页LncRNA预测目的：对拼接得到的UniGene进行LncRNA(LongnoncodingRNA)预测。

原理：通过以下过程对UniGene进行过滤，最终得到候选LncRNA序列。

1)Unigenelength>200bp；

2)UnigeneORF(OpenReadingFrame)length<300；

3)将满足长度条件的UniGene与多个近源物种进行进化分析，得到序列的保守性和进化特性；

4)根据上述的特性和已知数据库中coding、noncoding区域的特性建立编码筛选模型；

5)将符合noncoding模型的UniGene与Pfam等蛋白域数据库进行同源性比对，进一步去除可能的编码特性，最终得出LncRNA预测结果。第58页/共71页第59页/共71页RSAM‐01：模式动植物基因组数据和注释信息整合第60页/共71页第61页/共71页RSAM‐07：可变剪接分析可变剪接体与Exonski