生化实验技术与方法

生化实验技术与方法第1页，共23页，2023年，2月20日，星期六实验操作硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。1.2g硅胶H加4.0ml0.5%CMC溶液，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水平台上，自然晾干。第2页，共23页，2023年，2月20日，星期六2.板的处理：薄板的活化：105℃，0.5h

薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。3.点样：样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量8-10μl。注意：点样点的直径小于5mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。4.展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。5.显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。第3页，共23页，2023年，2月20日，星期六20mm10mm30mm8mm第4页，共23页，2023年，2月20日，星期六第5页，共23页，2023年，2月20日，星期六苯丙氨酸解氨酶的提取纯化

实验原理苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonialyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。第6页，共23页，2023年，2月20日，星期六仪器高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统试剂酶提取液：0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巯基乙醇）固体硫酸铵0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA，2.5%甘油，20mmol/Lβ-巯基乙醇）；DEAE纤维素52第7页，共23页，2023年，2月20日，星期六操作步骤酶液提取（1）植物材料2g，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上用研钵研磨。（2）将已匀浆的酶液转入离心管，4000r冷冻离心30min。（3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，留样0.5ml

。硫酸铵分级沉淀酶蛋白（1）根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和度应加入酶粗提液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。（240g/L)（2）将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌10min；然后于9000r离心15min，保留上清液于烧杯内。（3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵用量。（222g/L)（4）按上述（2）步同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。（5）将沉淀溶于2ml酶抽提液中,留样0.5ml

。透析脱盐酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透析过夜,留样0.5ml。第8页，共23页，2023年，2月20日，星期六银杏叶2g+10ml酶提取液研磨4000rpm、30min取上清液加硫酸铵至饱和度38%

9000rpm、15min取上清液加硫酸铵至饱和度75%

9000rpm、15min取沉淀溶于2ml酶抽提液透析第9页，共23页，2023年，2月20日，星期六纯化离子交换层析DEAE纤维素（1）称取DEAE纤维素52干粉1~1.5g，加20ml的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）浸泡4h以上（或浸泡过夜）。（2）装柱：把预处理的DEAE纤维素52装柱。装柱完成后，用2~3个床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）洗脱平衡该柱。（3）上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样结束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸盐缓冲液2~3cm厚液层。注意上样开始就收集流出液。（4）洗柱：约用2倍床体积的A液（0.02mol/L磷酸盐缓冲液）及B液（含1mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸盐缓冲液）洗柱，按洗脱管编号，取A280值高的管中洗脱液测其PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其体积（ml）。第10页，共23页，2023年，2月20日，星期六苯丙氨酸解氨酶的活力测定

PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若酶的加入量适当，A290升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定A290升高的速率以测定PAL活力。规定1h内A290增加0.01为PAL的一个活力单位。第11页，共23页，2023年，2月20日，星期六取试管2支，按表中所述（0号为调零管，1号为测定管。注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：ml）

试剂类型调零管（0号）待测管（1号）pH8.7的0.1mol/L硼酸缓冲液320.1mol/LL-苯丙氨酸溶液0

1样品（酶）溶液0.1

0.1将各管混匀，放入40℃恒温水浴保温1h（准确计时），到时各加0.2ml2mol/LHCl终止反应。紫外分光光度于波长290nm处测定1号管的A290。第12页，共23页，2023年，2月20日，星期六蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）取酶液0.1ml，用蒸馏水稀释至5ml取试管8支，按下表加入各溶液：将上述各试管混匀，静置2min，测定各管的A595。

试管编号01234567标准蛋白质溶液（ml）50ug/ml00.20.40.60.81.0//稀释酶液（ml）//////1.01.0蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.01.01.0考马斯亮蓝（ml）2.02.02.02.02.02.02.02.0第13页，共23页，2023年，2月20日，星期六PAL总活力、比活力、蛋白质含量的计算步骤体积（ml）蛋白质含量（mg）总活力（m）比活力（m/mgprotein）粗提硫酸铵沉淀透析离子交换层析第14页，共23页，2023年，2月20日，星期六SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

（SDS－PAGE）测定蛋白质分子量

原理：SDS－PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。第15页，共23页，2023年，2月20日，星期六SDS是在PAG系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。

SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性。2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。SDS-蛋白质复合物的特点：1.由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。第16页，共23页，2023年，2月20日，星期六测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，lgMr为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的lgMr，再换算成蛋白质分子量．第17页，共23页，2023年，2月20日，星期六

在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。第18页，共23页，2023年，2月20日，星期六操作如同PAGE。样品：蛋白质要完全变性。蛋白质+SDS+巯基乙醇100℃2-5分钟标准蛋白市场有售，被测蛋白质的分子量应在标准蛋白分子量以内。染色：考马氏亮蓝、银染色该法测定蛋白质分子量的局限性：1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。2.电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）第19页，共23页，2023年，2月20日，星期六实验操作编号溶液名称12%分离胶4%浓缩胶130%Acr–0.8%Bis2.0ml0.2ml2pH8.8Tris-HCI1.25ml-3pH6.8Tris-HCI-0.375ml410%SDS50ul15ul5TEMED5ul5ul610%AP50ul15ul7H2O1.65mlo.9ml总体积约5mL约1.5mL

胶的制备第20页，共23页，2023年，2月20日，星期六标准蛋白质分子量兔磷酸化酶B97400牛血清白蛋白66200兔肌动蛋白43000牛碳酸酐酶31000胰蛋白酶抑制剂20100鸡蛋清溶菌酶14400第21页，共23页，2023年，2月20日，星期六样品的处理：按0.5mg蛋白质/1mL溶液的比例向标准蛋白质或待测样品中加入样品溶解液（小试管），充分溶解后，置沸水浴3min，取出冷至室温。加样量：20μl，标准蛋白（M）全加。电泳：点样端负极，恒压：开始80V，待样品进入分离胶后120V。电极缓