肿瘤的分子生物学检验专家讲座

肿瘤分子生物学检验

2015.11.30

肿瘤的分子生物学检验专家讲座第1页肿瘤标志物研究历史第1阶段（1963-1978）：癌胚性抗原1963年Abelev

AFP1965年Gold&Freeman

CEA第2阶段（1979-1989）：糖链抗原为主1980年Koprowski

CA19-9（1116-NS-19-9）1981年Bast

CA125（OC125）第3阶段（1990以后）：基因标志肿瘤基因标志2肿瘤的分子生物学检验专家讲座第2页一、原癌基因(oncogene，onc)及其表示产物作用

1、定义：

原癌基因是指人类或其它动物细胞（以及致癌病毒）固有一类基因，能诱导细胞正常转化并使之取得新生物特征基因总称。原癌基因包含病毒癌基因（v-onc）和细胞癌基因（c-onc）两种，它们在正常情况下以非激活形式存在，故称原癌基因。负责调控正常细胞生命活动，包含细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进展、细胞存活以及DNA转录等。一旦这类基因发生一些错误或功效丧失时，极易造成原癌基因转变为可使正常细胞转化为肿瘤转化基因或癌基因。3肿瘤的分子生物学检验专家讲座第3页42、特点：

（1）v-onc是病毒基因组中特殊核苷酸序列，能

引发细胞转化

（2）c-onc是存在于正常细胞基因组中癌基因，

在正常情况下处于静止或低表示状态，不

仅对细胞无害，而且对维持细胞正常功效具

有主要作用，但在异常表示时，其产物可使

细胞无限制分裂

肿瘤的分子生物学检验专家讲座第4页5细胞癌基因与病毒癌基因核酸序列有同源性即它们DNA序列是相对应，表示产物也基本相同肿瘤的分子生物学检验专家讲座第5页细胞癌基因作用：

经过其表示产物蛋白质来表示，负责调控正常细胞生命活动，包含细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进展、细胞存活以及DNA转录等。

6肿瘤的分子生物学检验专家讲座第6页7二、癌基因定义：原癌基因在进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，包含细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进展、细胞存活以及DNA转录等。一旦这类基因发生一些错误或功效丧失时，极易造成原癌基因转变为可使正常细胞转化为肿瘤转化基因或癌基因肿瘤的分子生物学检验专家讲座第7页三、原癌基因激活机制

原癌基因含有正常生理功效，被激活时又含有致癌能力，所以研究原癌基因怎样被激活是很主要。

现已证实

射线辐射

化学致癌剂

病毒感染

8肿瘤的分子生物学检验专家讲座第8页(一)原癌基因点突变(pointmutation)

癌基因在编码次序特定位置上某一个核苷酸发生突变，使其表示蛋白质中对应氨基酸发生改变，从而取得了转化细胞活性9mutation肿瘤的分子生物学检验专家讲座第9页(二)原癌基因取得外源开启子而激活

肿瘤细胞中原癌基因表示水平能够其转录mRNA或翻译产物蛋白质含量来表示

在原癌基因上游插入外源性开启子或增强子可激活原癌基因，使其表示产物增多

病毒增强子常位于5’端长末端重复序列(1ongterminalrepeat，LTR)内。假如增强子插入到原癌基因附近或远处，均使之激活，促使癌基因表示比正常表示增高几十甚至上百倍

10肿瘤的分子生物学检验专家讲座第10页(三)原癌基因甲基化程度降低而激活

DNA分子中甲基化(methylation)对阻抑基因转录含有主要作用11肿瘤的分子生物学检验专家讲座第11页现已发觉在结肠腺癌和小细胞肺癌细胞中，ras基因DNA甲基化水平比其邻近正常细胞显著偏低，提醒一些原癌基因是因为甲基化程度降低而激活12肿瘤的分子生物学检验专家讲座第12页(四)原癌基因拷贝数增加

基因扩增(amplification)：

一些癌基因经过一些机制在原来染色体上复制多个拷贝，超出了正常细胞癌基因剂量，造成基因产物增加，从而使细胞正常功效紊乱

比如：

人视网膜母细胞瘤：N-myc扩增了10-200倍，对应mRNA和蛋白质产物也都大量增加13肿瘤的分子生物学检验专家讲座第13页

(五)基因易位或重排使原癌基因激活

基因易位（translocation）

基因重排（rearrangemant）：

有些癌基因从其染色体正常位置转移到另一染色体某个位置，因为调控环境发生改变，造成从相对静止状态变成激活状态，使原癌基因表示产物显著增加而造成肿瘤发生

14肿瘤的分子生物学检验专家讲座第14页

染色体易位使位于9q34c-abl基因转移到第22对染色体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表示增高，蛋白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，造成慢性粒细胞白血病发生

15肿瘤的分子生物学检验专家讲座第15页

四、抑癌基因

抑癌基因(suppressergene)又称抗癌基因(anti-onc)，是存在于正常细胞内一类可抑制细胞生长基因，并有潜在抑癌作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引发细胞恶性转化而造成肿瘤发生

16肿瘤的分子生物学检验专家讲座第16页（一）抑癌基因及其表示产物

抑癌基因与调控细胞分裂和分化过程相关，可能与生长因子、一些蛋白激酶类活性亲密相关，只是抑癌基因给予细胞信号与原癌基因相反17肿瘤的分子生物学检验专家讲座第17页（二）抑癌基因失活机理

1、视网膜母细胞瘤(retino-blastoma，Rb)

（1）特点：

★基因组成：27个外显子，3-17外显子区域是基

因重组和突变热点

★编码：p105蛋白质，其有结合DNA活性，

可受各种激酶系统催化而发生磷酸化18肿瘤的分子生物学检验专家讲座第18页19

（2）作用：

不一样程度磷酸化后，都可使p105活性缺乏或完全消失。非磷酸化Rb可预防细胞增殖，当DNA肿瘤病毒抗原结合了非磷酸化Rb时，Rb活性就受到抑制，使细胞转化为无限增殖状态，形成肿瘤肿瘤的分子生物学检验专家讲座第19页对于大量来自视网膜母细胞瘤Rb基因序列进行分析，发觉Rb基因完全或部分发生缺失；另一些Rb肿瘤中，基因完整，但序列分析显示有一个突变，它常发生于剪接点上，因为这一变异造成RbmRNA组装时有外显子被遗漏，因而产生异常Rb蛋白质

20肿瘤的分子生物学检验专家讲座第20页

抑癌基因又称为隐性癌基因21

基因1基因2原癌基因MW肿瘤抑癌基因MW

MM肿瘤肿瘤的分子生物学检验专家讲座第21页（2）p53基因

★特点：17p13，11个外显子，10个内含子

★编码：393个氨基酸，p5322肿瘤的分子生物学检验专家讲座第22页★作用：产物能结合DNA和被磷酸化。

（1）抑制肿瘤细胞停滞在修复前期不能进入S期复制DNA而促使细胞凋亡23肿瘤的分子生物学检验专家讲座第23页24野生型p53蛋白质

p53下调bcl-2而上调bax，促进细胞凋亡过程。向丢失p53等位基因肿瘤细胞中导入野生型p53就会使肿瘤细胞凋亡肿瘤的分子生物学检验专家讲座第24页25

正常细胞生长增殖由两大基因调控正调控信号：促进细胞生长和增殖，而且阻止其发生终末分化—癌基因

负调控信号：促进细胞成熟，向终末分化，最后凋亡（apoptosis）—抑癌基因

两种信号保持着动态平衡，对正常细胞生长、增殖、死亡准确地调控，当平衡被破坏，正调控信号基因功效过盛或负调控信号基因失活，造成细胞增殖调控混乱而使细胞恶变肿瘤的分子生物学检验专家讲座第25页

原癌基因激活

1、ras基因变异

2．myc基因变异26抑癌基因失活

1、Rb基因失活

2、p53基因失活

3、其它：

BRCA1和BRCA2：与遗传性高发乳腺癌相关基因，与卵巢癌发生也紧密相关

肿瘤的分子生物学检验专家讲座第26页五、检测方法：

1、PCR／ASO探针法(PCR-allele-specific

oligonucleotide）

被检基因片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经标识野生型和突变型靶基因序列寡核苷酸探针杂交。因为长度为20个碱基左右探针中仅1个碱基差异便会使其Tm值下降5.0~7.5℃，所以经过严格控制杂交条件，能够使PCR产物与完全互补探针进行杂交，也即野生型序列产物仅与野生型探针杂交，含突变序列产物仅与突变探针杂交。依据有没有杂交信号可判断被检扩增片段中是否带有突变点。

27肿瘤的分子生物学检验专家讲座第27页2、限制性片段长度多态性(RFLP)分析

聚合酶链式反应—限制性片段长度多态（PCR—RFLP）分析技术是在PCR技术基础上发展起来。DNA碱基置换恰好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质改变，PCR特异扩增包含碱基置换这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应用PCR—RFLP，可检测某一致病基因已知点突变，进行直接基因诊疗，也能够此为遗传标识进行连锁分析进行间接基因诊疗。

28肿瘤的分子生物学检验专家讲座第28页293、PCR-SSCP、测序等单链DNA分子含有特定二级空间构象，取决于该分子本身碱基组成突变DNAPCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不一样两条单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不一样构象单链片段含有不一样电泳迁移率，从而能区分正常与突变DNA肿瘤的分子生物学检验专家讲座第29页304、变性梯度凝胶电泳(DGGE)在设计引物时应使被扩增靶基因片段两端含有不一样Tm值，一端较高，另一端相对较低。将PCR产物在含有梯度浓度变性剂聚丙烯酰胺凝胶中进行分离，当泳动至变性剂对应浓度位置时，产物片段中Tm值较低一端双链被部分变性而解链，这种部分解链构象致使该片段电泳迁移率大大降低。因为野生序列与突变序列PCR产物片段Tm不一样，它们在电泳过程中被部分解链先后不一样，经过一定时间电泳，能够发觉这些产物片段在凝胶中所处位置也不一样，据此，能够区分野生序列片段还是突变序列片段。肿瘤的分子生物学检验专家讲座第30页315、Sout