血细胞P五三基因表达检测专家讲座

血细胞P53基因表示检测

——RT-PCR

湘雅医检1501血细胞P五三基因表达检测专家讲座第1页P53基因P53基因命名该基因编码一个分子量为53kDa蛋白质功效作用主要抑癌基因，预防癌变细胞基因修复功效血细胞P五三基因表达检测专家讲座第2页RT-PCRRT-PCR(反转录PCR技术)RNA反转录（reversetranscription）和cDNA聚合酶链式扩增（PCR）相结合技术。血细胞P五三基因表达检测专家讲座第3页在GenBank中查找p53基因设计引物确定参数检测p53基因在血细胞中表示反转录引物五个主要问题基因表示检测方法血细胞P五三基因表达检测专家讲座第4页基因表示检测方法Ques血细胞P五三基因表达检测专家讲座第5页在蛋白质水平基因检测方法在DNA水平在mrna水平Northern印记杂交RT-PCR.......血细胞P五三基因表达检测专家讲座第6页ReverseTranscriptionPCR

RNA提取cDNA反转录PCRNorthern印记杂交Northern印记杂交基因表示水平随机六核苷酸引物引导Oligo(dT)引导特异性引导血细胞P五三基因表达检测专家讲座第7页反转录Ques血细胞P五三基因表达检测专家讲座第8页反转录酶逆转录酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒体内依赖RNADNA聚合酶，最少含有以下三种活性：(1)依赖RNADNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中RNA；(3)依赖DNADNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补双链cDNA.

血细胞P五三基因表达检测专家讲座第9页反转录可用引物010305

Oligo(dT)：是一个对mRNA特异方法。因绝大多数真核细胞mRNA含有3’端Poly(A)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。

随机六聚体引物：用此种方法时，体系中全部RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要特异性。通惯用此引物合成cDNA中96%起源于rRNA。特异性引物：用含目标RNA互补序列寡核苷酸作为引物，用这类引物仅产生所需要cDNA，造成更为特异PCR扩增。血细胞P五三基因表达检测专家讲座第10页GENBANK中查找P53基因Ques血细胞P五三基因表达检测专家讲座第11页查找P53序列使用genbank，p53登陆号AH007667/genbank血细胞P五三基因表达检测专家讲座第12页查找P53序列血细胞P五三基因表达检测专家讲座第13页查找P53序列血细胞P五三基因表达检测专家讲座第14页查找P53序列血细胞P五三基因表达检测专家讲座第15页引物设计标准15263748引物应用核酸系列保守区内设计并含有特异性产物不能形成二级结构引物长度普通在15~30碱基之间G+C含量在40%~60%之间碱基要随机分布引物本身及之间不能有连续4个碱基互补引物5′端能够修饰引物3’端不可修饰引物3′端要避开密码子第3位血细胞P五三基因表达检测专家讲座第16页设计引物确定参数Ques血细胞P五三基因表达检测专家讲座第17页引物设计Primerpremier5.0Primer

Premier5.0是由加拿大Premier企业开发专业用于PCR或测序引物以及杂交探针设计、评定软件，其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer

Design），酶切分析窗口（Restriction

Sites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引物设计功效。血细胞P五三基因表达检测专家讲座第18页引物设计1开启界面血细胞P五三基因表达检测专家讲座第19页引物设计2在此输入需扩增DNA序列血细胞P五三基因表达检测专家讲座第20页引物设计3血细胞P五三基因表达检测专家讲座第21页引物设计4血细胞P五三基因表达检测专家讲座第22页引物设计5血细胞P五三基因表达检测专家讲座第23页引物设计6血细胞P五三基因表达检测专家讲座第24页引物设计7血细胞P五三基因表达检测专家讲座第25页引物设计8Hairpin：发夹结构Dimer：二聚体FalsePriming：错配CrossDimer：交叉二聚体血细胞P五三基因表达检测专家讲座第26页引物设计9血细胞P五三基因表达检测专家讲座第27页引物设计10血细胞P五三基因表达检测专家讲座第28页引物设计11保留选择满意引物血细胞P五三基因表达检测专家讲座第29页引物设计12所选引物血细胞P五三基因表达检测专家讲座第30页确定参数cDNAsize:434bp94度30秒变性155度45秒退火273度60秒延伸327次循环4血细胞P五三基因表达检测专家讲座第31页确定参数四项参数循环次数退火延伸变性模板DNA由双链变成单链，有利于与引物结合。可依据模板复杂程度调整变性温度和时间，普通情况下94C30秒可使各种复杂DNA分子完全变性。变性DNA快速冷却至40－60C可使引物和模板DNA发生结合。可依据引物长度和G＋C含量选择复性温度普通是70－75C，此时TaqDNA聚合酶活性最高。<1kb，1分钟；>1kb可适当延长时间。理论上20－25个循环PCR产物累计即可到达最大值、实际操作中25－30较合理。血细胞P五三基因表达检测专家讲座第32页确定参数退火温度：50℃~54℃血细胞P五三基因表达检测专家讲座第33页检测p53基因表示Ques血细胞P五三基因表达检测专家讲座第34页检测基因表示依据产物长度制作适宜浓度琼脂糖凝胶，取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳45－60min。成像系统成像分析。琼脂糖凝胶电泳分离产物：血细胞P五三基因表达检测专家讲座第35页检测基因表示1