碳源及碳氮比

碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响农村生态环境2005,21(2):42—45RuralEco—Environment碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响傅利剑,郭丹钊,史春龙,黄为一(南京农业高校生命科学学院微生物学系/农业部农业环境微生物工程重点开放试验室，江苏南京210095)摘要:碳源(甘油和柠檬酸钠)及碳氮比对纯培育的异养反硝化菌HP1(Pseudomono,salcaligenes)异养反硝化力量影响的试验表明,碳源种类对硝酸还原酶活性没有明显影响,对氧化亚氮还原酶活性有影响.批式培育方式下最适C/N为8,菌株HP1可以采用NO;作为唯一氮源进行反硝化作用，证明HP1至少有2种硝酸还原途径.连续培育方式下温度对菌株HP1异养反硝化作用中间产物的积累有影响，不同C/N时均有NH积累,C/N为3时还有N0;的积累.关键词:异养反硝化微生物;反硝化作用；碳源;C/N中图分类号:X172;Q935文献标识码:A文章编号：1001—5906(2005)02—0042—04E岱ectofcarbonsourceandC/Nratioonheterotrophicdenitrificationofpureculture.FAOn,GUODan一zhao,巩建华,柯尊伟,李季.河北省藁城市蔬菜种植区化肥施用与地下水硝酸盐污染争论[J].农村生态环境,2004,20(1):56—59KesserOP,Kissi,BihariZ,etal.Biologicaldenitrificationinacontinuous?flowpilotbioreactorcontainingimmobilizedPseudo一ilPlbasbutanovoracells[J].BioresourceTechnol,2003,87(1):75—80BaumannB,vanderMeerJR,SnozziM,etal.Inhibitionofdenitri.ficationactivitybutnotofmRNAinductioninParacoccu^denitrifi?cansbynitriteatasuboptimalpH[J].AntonievanLeeuwenhoek,1997,72(3):183—189BaumannB,SnozziM,ZehnderAJB,etal.Dynamicsofdenitrifi一cationactivityofParacoccu^denitrifieansincontinuousculturedur?ingaerobic―anaerobicchanges[J].JBact,1996,178(15):4367—4374史春龙.富养分化湖泊底泥中反硝化微生物及其反硝化作用[D].南京:南京农业高校,2002:42—43格哈特.一般细菌学方法手册[M].厦门高校生物学系微生物争论室译.厦门：厦门高校出版社，1989:625—626李军,杨秀山，彭永臻.微生物与水处理[M].北京:化学工业出版社，2002:378—380SamuelsonM.Dissimilatorynitratereductiontonitrite,nitrousox一ide,andammoniumbyPseudomonasputrefaz，iens[J].ApplEnvironMicrobiol,1985,50(4):812—815作者简介:傅利剑（1979—），男,湖北武汉人,硕士生,主要从事富养分化湖泊，地下水中硝态氮的生物去除方面的研究.(上接第41页)SoilEcol,1998,10(3):239—251[7FerrisH,VenetteRC,ScowKM.SoiImanagementtoenhancebae-terivoreandfungivorenematodepopulationsandtheirnitrogenmineralisationfunction[J].ApplSoilEcol,2004,25(1):19一358]BerkelmansR,FerrisH,TenutaM.Effectsoflong?termcropman?agementonnematodetrophiclevelsotherthanplantfeedersdisap一pearafterlyearofdisruptivesoiImanagement[J]ApplSoilEcol,2003,23(3):223,2359]BongersT,vanderMeulenH,KorthalsG.Inverserelationshipbe?tweenthenematodematurityindexandplantparasiteindexunderenrichednutrientconditions[J].ApplSoilEcol,1997,6(2):195—199[10]张荣祖，陈鹏,杨明宪,等.长白山北坡森林生态系统土壤动物初步调查[J].森林生态系统争论，1980(1):133—152殷秀琴,王海霞,周道玮.松嫩草原区不同农业生态系统土壤动物群落特征[J].生态,2003,23(6):1071—1078ImazA,HernfndezMA,ArifioAH,etalDiversityofsoiInema一todesacrossaMediterraneanecotone[J].ApplSoilEcol,2002,20(3):191一198岳天祥.生物多样性争论及其问题[J]生态,2001,21(3):462—467郑师章，吴干红,王海波,等.一般生态学M],上海:复旦高校出版社，1994:160作者简介:吴东辉（1971—），男，黑龙江望奎人，博士生,主要从事土壤动物生态学争论.?纠rl_[[_【sHIChun—1ongHUANGWei一yiODepartmentofMicrobiology,CollegeofLifeSciences,NanjingAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofMicrobiologicalEngineeringofAgriculturalEnvironment,MinistryofAgriculture,Nanjing210095,China).RuralEco—Environment,20HD5,21(2):42―45Abstract:StrainHPIwasisolatedfromsedimentandidentifiedasPseudomonasaIcaligenes.Atestwascarriedouttode一termineeffectsofcarbonsourceandC/NratioondenitrificationofpurecultureResultsshowthatcarbonsourcehadlittleeffectonnitratereductaseactivity,butobviouseffectonnitrousoxidereductaseactivity,TheoptimalC/Nratiowas8inbatchdenitrificationtests,andwithC/Nratiosbeing<8or>8,theN20concentrationwaslowerundertheconditionofa一cetyleneinhibitionThestudyshowthatStrainHPlcouldgrowwithnitrateasitssolenitrogensource.ItWasconfirmedthatnitratewaspartlyconsumedasnitrogensourcewhendenitrificationwascarriedout,andStrainHPIhadtwokindsofnitratereductaseatleast.Therewerealotofintermediatesaccumulatedincontinuouscu1tureatdifferentC/Nratio.suchasni一nitriteaccumulatedatC/Nratioof20,Theobjectiveofthepresentstudywastoprovidemethodsforsubsequentresearch,Keywords:heterotrophicdenitrifier;denitrification;carbonsource;C/Nratio反硝化作用是地球氮循环过程中一个重要的生物过程.它是在厌氧条件下,反硝化微生物采用氮氧化物作为电子受体,最终转化成氮气的生物过程J.由于这个生物学性质,反硝化作用在富养分化湖？白防治,高硝酸盐含量地下水治理和工业废水处理中已受到越来越多的重视,.对某一特定的菌株而言,进行完整的反硝化作用是特别简单的过程,包括一系列的还原反应和电子传递,受很多环境因素的影响,诸如0,温度，pH值,碳源（同时为异养反硝化微生物的电子供体），C/N（指碳源碳与硝态氮的摩尔比值,全文相同）等.各因素对微生物反硝化作用的影响是从不同方面体现出来的，有的影响酶的合成，有的影响酶的活性J.影响结果可从中间产物或终产物的形态,数量以及酶的合成状况上表现出来.目前，国内对纯培育反硝化微生物的争论较少,本文争论了异养反硝化微生物的代谢特征，为高硝酸盐含量地下水的治理供应科学依据.1材料与方法试验菌种菌株HP1（Pseudomonasalcaligenes）,系南京农业高校/农业部农业环境微生物工程重点开放试验室分别自富养分化湖泊底泥.基金项目：上海市科技兴农重点攻关项目（农科攻字98第05—2号）收稿日期：2004—06—22?通讯联系人第2期傅利剑等:碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响43L2培育基.1碳源测试培育基以Gihay培育基？中除碳源以外的其他成分作为基础培育基•加入待测碳源（甘油或柠檬酸钠），最终碳浓度为50mol?L,.配制厌氧培育基时1L培育基中加入ImLl.0g?L的刃天青指示剂和0.3g半胱氨酸,在氮气爱护下配制并分装到Hun.gate试管中.凡厌氧培育基，皆按此方法配制.1.2.2碳氮比测试培育基批式培育测定：以甘油为碳源,设定甘油一C与N03--N的比值（摩尔比）分别为3:1,6:1,8:1,10:1,20:1和50:1.连续培育测定：以柠檬酸钠为碳源，设定柠檬酸钠一C与N03—N的比值（摩尔比）分别为3:1,20:1.流加培育基和批式培育基成分相同.NO;为氮源培育液:Giltay培育基中不加天冬酰胺，其他成分相同.试验设计柠檬酸钠是分别菌株HP1所选用的碳源,对菌株HP1进行碳源种类试验时,甘油处理组是所选碳源中反硝化作用最强的，所以在碳源测试中选用甘油和柠檬酸钠2种碳源.按上述要求配制好培育基后接人活化菌株HP1,在25?下培育,定时取样测定N03—N,NO;-N,NH4+-N,加乙快和不加乙快时的N0.为测试碳源种类对氧化亚氮还原酶活性的影响，分别设置了加乙快和不加乙快处理组.它的原理是溶解于溶液中的乙烘可抑制氧化亚氮还原酶，使反应产生的中间产物N0积累而不被进一步还原为N,对参加反硝化作用的其他酶没有影响.通过比较2种处理N0的产量可以得出氧化亚氮还原酶的活性.C/N试验分别在批式和连？蛭C续培育条件下进行.批式培育选用甘油为碳源,而连续培育选用柠檬酸钠为碳源，这是由于用甘油配制Giltay培育基易产生沉淀,不利于连续培育的操作.方法恒化器的运行:稀释速率0.045h,,反应器置于设定温度下培育.NO;测定采纳Cu.Cd柱还原法,N0;测定采纳苯磺酸-盐酸一N-1.蔡乙二氨比色法,NH;测定采纳纳氏试剂比色法J.N,0测定采用气相色谱法J,生物量的测定:发酵液5mL,10000r?min离心lOmin.取沉淀于105?下烘至恒重，以未接菌的空白培育基作对比.2结果与争论2.1碳源对菌株HP1异养反硝化作用的影响碳源对菌株HP1异养反硝化作用的影响见图1.由图1可知,HP1采用柠檬酸钠或甘油为碳源，在检测时间段内均有肯定量的N03-残留，变化范围在3.92,5.08mg?L,.N02积累量也无明显区别，变化趋势全都.以柠檬酸钠为碳源时,N0;平均值为3.92mg?L,,以甘油为碳源时则为4.30mg?L,.2种碳源条件下,NH4+的积累呈现明显不同的变化趋势,N0浓度的变化也有较大差别.在不加乙快抑制时，柠檬酸钠试验组检测不到N,0,甘油试验组在12h为0.为g?L,,随后开头下降，到18h为0.13mg?L,.加乙快抑制时,2处理组N0浓度在前13h均呈提升趋势;在随后的时间内，柠檬酸钠试验组开头下降，到15h趋于平稳，N0浓度为14.5mg?L,.甘油试验组则始终呈提升趋势，到18hN0浓度达24mg?L,.]5]6]7]t/ht/h十加乙快N20;+不加乙快N20;卜镂态氮;一矗一硝态氮;一*一亚硝态氮图1碳源对菌株HP1异养反硝化作用的影响g),越蛭ezFig.lEffectofcarbonsourceOndenitrificationofStraing),越蛭ez一_?E),越蛭［)z一一一？g),趟蛭+zz?加mO—{}g),越蛭1)z一n?量)，越蛭e乙一,」月g),蛰蛭+}lz??柏?加mO?加mO农村生态环境第21卷上述结果表明,碳源种类对硝酸还原酶没有明显影响，但对氧化亚氮还原酶有影响.甘油为碳源时氧化亚氮还原酶活性在试验开头时较低，这表现在不加乙快抑制时有NO被检测出，而以柠檬酸钠甘油为碳源时,加乙快处为碳源时无N,0的积累.理组17h前NO浓度低于柠檬酸钠为碳源时的浓度,至17h后NO浓度持续提升,超过了柠檬酸钠为碳源时的浓度.作为异养反硝化菌株HP1的电子供体，甘油比柠檬酸钠的效果好.至于NH;的积累，可能是菌体自溶后释放而来的,也可能是还原产生的.在本试验中，由于测试时间短,后一种可能性较大.2.2批式培育时碳氮比对菌株HP1异养反硝化作用的影响异养反硝化作用所需作为电子供体的碳源的计算公式为：c(0C)=2.86c(N03一N)+1.71c(NO;—N)+c(DO)(1)式中，c(OC)所需有机碳浓度,mol?L,;c(N03-一N):处理水中硝态氮浓度,mol?L,;c(N02-一N):处理水中亚硝态氮浓度,mol?L'.;c(DO):处理水中溶解氧浓度,mol?L,.由公式(1)可推导出在无氧条件下，反硝化作用所需碳与硝态氮和亚硝态氮之和的理论比值为4.6:1(摩尔比).在异养微生物生长代谢过程中，有机碳除作电子供体外，还作为碳源养分物用来合成微生物生长所需物质而被消耗，所以实际需要的有机碳量大于由公式⑴计算出的理论比值(4.6:1).批式培育条件下碳氮比对菌株HP1异养反硝化作用的影响见图2,试验结果符合上述推论.由图2可知,C/N为3:1时碳源不足，NO浓度低于其他试验组；当C/N为8:1时,N:0浓度在各试验组中最高；当C/N超过8:1时,NO浓度反而降低.可见在批式培育时HP1培育的最适C/N为8:1.但为什么当C/N高于8时NO浓度反而下降呢?上述试验证明甘油对菌株HP1的异养反硝化没有明显抑制作用.菌株HP1在N03为氮源的培养液中生长60h后氮的变化状况见表1.由表1可知,HP1可采用N03作为唯一氮源进行异养反硝化作用.当C/N高于8时,碳源相对〃过剩〃,要消耗部分NOr作为氮源,作为电子受体的NO相对减少，因此还原产生的NO量降低.由此可见,菌株HP1对硝酸还原至少有2种途径.353025曼2015烂10z5图2C/N对菌株HP1异养反硝化作用的影响Fig.2EffectofC/NondenitrificationofStrainHPl表1菌株HP1在NO;为氮源的培育液中生长60h后氮的变化TablelChangeinnitrogenincultureofStrainllPlwithnitrateasnitrogensourceafter60hoursnig?L2.3连续培育时碳氮比对菌株HP1异养反硝化作用的影响菌株HP1在连续培育中不同碳氮比时的生长状况见表2.表2菌株HP1在不同碳氮比连续培育中的生长状况Table2EffectofC/NongrowthofStrainHPlincontin-hOBSculture1)以十重计.由表2可知,连续培育时有大量NH4+生成,温度对其含量有明显影响,温度低时NH4+浓度高.由于试验设计的温度范围不足以导致氨的挥发，因此温度对NH4+生成的影响不是由氨的挥发引起的：当碳氮比较低时(3:1),培育液中能检测到NO的存在,且温度高时N02-浓度高;但在碳氮比为20:1时则检测不到N0;•为何会有大量NH4+的积累？缘由尚不清晰.至于N0;积累的缘由，有2种可第2期傅利剑等:碳源及碳氮比对异养反硝化微生物异养反硝化作用的影响45能:一是随着C/N降低,碳源相对不足,N0［浓度相对提升,可促进异养反