生态毒理赵蕴琛 3 实验三

14生态赵蕴琛单细胞凝胶电泳技术检测吸烟者口腔粘膜上皮细胞DNA的损伤2016年11月11日姓名赵蕴琛指导老师肖慧专业年级生态学2014级学目单细胞凝胶电泳技术检测吸烟者口腔粘膜上皮细胞DNA的损伤实验目的采用单细胞凝胶电泳技术检测吸烟和非吸烟人群口腔粘膜脱落上皮细胞DNA损伤,来探讨吸烟致机体损伤的分子机制,评价吸烟的危害性,进一步验证单细胞凝胶电泳技术在人群分子流行病学研究中的应用价值。实验原理激光是光受激辐射放大的简称,由于其单色性好、方向性强、亮度高,已被广泛地应用于生物医学相关研究[1]。由于生物大分子吸收激光能量而被激活,产生受激原子、分子和自由基等,引起DNA单链断裂（singlestrandbreak,SSB），会影响DNA的遗传行为，从而产生相应的生物学效应[2]。单细胞凝胶电泳(singlecellgelelectrophoresis)方法可敏感检测单细胞水平的DNA链断裂,已成为一种快速、灵敏、简便的检测毒物致任何真核细胞DNA损伤的方法。[3]单细胞凝胶电泳技术原理：细胞裂解使细胞膜、核膜结构受到破坏，胞内的蛋白质、RNA及其他成分扩散到裂解液中，而核DNA相对分子质量很高，只能留在原位；在碱处理和碱性电泳液作用下DNA解螺旋、变性为单链。在标准实验条件下，正常细胞DNA不受损伤，结构完整，外加的电泳电流不会使DNA在凝胶中泳动。因此，正常对照组细胞DNA电泳后仍应保持在原来位置；断链的DNA相对分子质量较小，所以在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶中向阳极移动，形成彗星状图像。DNA受损伤愈严重，产生的断链和碱易变性片段就愈多，断链也愈小；在相同电泳条件迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。因此，通过彗星细胞不同级别的统计可以很好地反映细胞DNA的损伤程度。实验仪器和对象3.1仪器正常熔点琼脂糖(NMPA)及低熔点琼脂糖(LMPA)，溴化乙啶(EB,SIGMA分装)，十二烷基肌氨酸钠(Amresco公司)，TritonX-100、二甲亚砜、甲醇、NaOH、Tris-HCL、PBS等购自上海化学试剂公司。裂解液和电泳缓冲液在临用前配制。DYY-6B型稳压稳流电泳仪及水平电泳槽(北京六一仪器厂)，BHW-Ⅳ电热恒温水浴箱(北京市医疗设备厂)，OLYMPUSBX60荧光倒置显微镜、NIKON数码相机(日本)，移液器、离心机、离心管、磨砂边载玻片等常规实验设备。3.2实验对象本研究对象41例,分吸烟组和非吸烟组。按WHO(1984)关于吸烟调查方法标准建议,将吸烟≥1支/d,持续吸烟≥1a定为吸烟者。吸烟组24例,均为男性,年龄为25～91岁,平均年龄为(54.7±17.4)岁;非吸烟组17例,男6例,女11例,年龄为19～69岁,平均年龄为(41.3±16.9)岁。两组均无放射性或其他有毒化学物质接触史及饮酒史,半年内无感染史和服药史,口腔内无局部刺激因素。实验方法1采集样本受试者清洗口腔后,用压舌板轻刮口腔粘膜,再用生理盐水漱口3min,漱口液收集在离心管内,避光室温下离心10min(1200r/min),弃去上清液,留置约1ml细胞悬液低温保存备用。2制片融化的10g/mlNMPA75μl浇注到磨砂的经预热的载玻片上,立即盖上盖玻片,使之均匀展开,置4℃冰箱5min,待其固化后轻轻移去盖玻片,此为第1层。取10μl离心后的细胞悬液与150μl的7g/mlLMPA于37℃混匀,然后滴加75μl于第1层琼脂糖上,立即予盖玻片覆盖,置4℃冰箱5min固化,轻轻推去盖玻片,此为第2层。最后滴加75μl的7g/mlLMPA作为第3层,加盖盖玻片。3裂解将载玻片浸没于新配制的裂解液中,4℃避光裂解90min。4解旋PBS漂洗后,载玻片置于盛有新配制的电泳缓冲液的水平电泳槽中,使液面高于载玻片2mm,电泳槽周围置冰块,4℃避光解旋30min。5电泳调节电压为25V,电流300mA,4℃下电泳30min。6中和、固定及染色用pH7.5的Tris-HCl中和缓冲液漂洗3次,每次5min。甲醇滴片固定10min。滴加5mg/L溴化乙啶(EB)50μl染色,加盖盖玻片,保存于湿盒内,24h内观察结果7观察、分析及统计学处理每张玻片随机选取5个视野共观察200个细胞,计数彗星细胞的个数,用目镜微尺(放大倍数为400)测量彗星细胞的总长、头长。计算彗星细胞百分率和尾长,彗星细胞率(%)=彗星细胞数200×100%,尾长=总长-头长,以(x±s)μm表示结果。用数码相机在统一的放大倍数下摄片。实验数据用SPSSforWindows10.0和SAS软件进行χ2检验和t检验。以上步骤均在低温、避光下进行,取样到制片过程不超过2h,以保证上皮细胞的生理活性和避免其他因素所致的细胞DNA损伤。每样本均制备2张平行玻片,整个实验重复2次。注意事项1.细胞悬液制备计数时要注意把红细胞区分开，否则影响真实细胞数，并且使白细胞的浓度尽量保持在(0.3-0.6)x1010个/L范围内，这样的细胞浓度有利于结果观察。低融点琼脂糖在融化过程中不宜放在电炉上，用50-60℃水浴将其融化。2.制胶时最好在恒温水浴箱内进行，或者将玻片先预热，以免胶凝固太快。3.加盖玻片时应尽量避免气泡；加盖玻片后先在水平的地方放置片刻后，再放人冰箱，这样可以使胶凝固得更加完全；拿掉盖玻片后应在室温稍置片刻，使表面过多的水分控干，以免细胞分布不匀。4.第二层胶应适当薄一点，尽量使细胞呈单层分布有利于计数和拍照。5.裂解液要新鲜配制，超过2h会影响效果；电泳液要新鲜，否则会影响电泳效果。实验结果未受损细胞为一无拖尾的圆形荧光核心;轻度损伤的细胞彗星图像为典型的“大头小尾”;随着损伤的加重,尾部逐渐增大,头部则相应变小,为“尾长头小”的图像(图1～图4)。图1正常细胞彗星图像(×400)图2轻度损伤细胞彗星图像(×400)图3中度损伤细胞彗星图像(×400)图4重度损伤细胞彗星图像(×400)1、吸烟组和非吸烟组的彗星试验结果由表1可见,吸烟组口腔粘膜脱落上皮细胞的彗星尾长和彗星率均明显高于非吸烟组。2、吸烟年限和吸烟量对彗星尾长和彗星率的影响由表2可见,随吸烟年限的增加,彗星尾长和彗星率均有增加。由表3可见,日均吸烟≤20支,随吸烟支数的增加,彗星尾长和彗星率均有增加,而日均吸烟>20支,则见彗星尾长和彗星率略有下降。3、两组不同年龄的彗星试验结果由表4可见,随年龄增大,彗星尾长增加,而50～岁年龄组彗星率略低于40～岁及以下年龄组。4、两组相同年龄和性别的彗星试验结果表5和表6对两组年龄>50岁和男性受试者分别进行分析,吸烟组的彗星尾长和彗星率明显高于非吸烟组。结果表明,吸烟组的口腔粘膜脱落上皮细胞的彗星尾长及彗星细胞率均高于非吸烟组。并且随着吸烟年限和吸烟量(<20支/d)的增加,DNA损伤程度加重。从趋势上看出,彗星实验结果有一定的剂量—效应关系。表明吸烟可造成口腔粘膜细胞的DNA损伤。我们认为吸烟造成的口腔粘膜细胞的DNA损伤可能与以下两个途径有关:(1)烟草对口腔粘膜的直接刺激,包括机械和高温刺激。(2)香烟在体内的代谢产物对组织细胞的化学刺激。思考题（一）试分析三层胶浓度不同的原因1.第一层胶的制备：将100μL45℃预热的由无Ca2+、Mg2+磷酸缓冲液配制的0.6％正常熔点琼脂糖(NMPA)滴在洁净的磨砂载玻片上，迅速盖上干净的盖玻片，立即放入4℃冰箱中10min使NMPA凝固，以便在下步移开盖玻片时不破坏第一层胶。2.第二层胶的制备：第一层胶凝固后，将10μL待测细胞悬液和90μL0.8％LMPA分别在37℃下预热并相混合，迅速滴到第一层凝胶上，立即盖上另一干净盖玻片，迅速置4℃10min。3.第三层胶的制备：第二层LMPA凝固后，在室温下小心移去盖玻片，滴加预热45℃的100μL含0.6％NMPA，盖上盖玻片4℃凝固。(二).试分析影响单细胞凝胶电泳实验结果的因素1.琼脂糖凝胶薄板的制备：该实验需要制备三层琼脂糖凝胶薄板，应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。第1层是紧贴冰冻玻片砂面的1%正常凝点（42±2）℃的琼脂糖凝胶，应置4℃存放约20分钟，如时间过短，不能得到“老化”的凝胶与玻片粘合不紧，容易在液体浸泡处理和电泳过程中自然脱落，造成实验失败；反之，如果放置时间过长，凝胶极易干裂而脱落。第2层凝胶是1%低凝点（26±2）℃琼脂糖液，与细胞混合时琼脂糖液的温度30~37℃，温度过高可引起细胞损伤，此操作过程力求快速，以免加速细胞DNA的修复。第三层可以不添加。2.细胞数和实验温度的影响：2.1实验细胞数应调至约3.0×105，如果细胞数过低，一张片子中细胞数太少，很难完成100个彗星计数分析；反之细胞数过高，片中细胞过密，位于不同层面的细胞相互重叠，难以分析彗星DNA损伤。2.2实验温度的控制。样品应置4℃环境下进行，以抑制或降低核酸内切酶等活性，阻止DNA损伤的修复，从而达到准确地检测DNA初级损伤。已有研究表明一些细胞DNA断裂损伤能在1小时内达到90%的修复，3小时达到97%，因此，应严格控制细胞在分析过程中的温度。3.碱化处理及电泳的条件：凝胶内的细胞需在碱性（pH值10）环境下进行处理，其作用一是去除细胞蛋白质，使DNA暴露出来；其次是碱化处理使DNA紧密螺旋结构解旋，DNA损伤片断及其极性端暴露出来。电泳条件：电压或电流过大，严重受损伤的细胞可能出现的拖尾过长，彗星消失而影响结果，其次是正常的细胞可能因电压或电流过大而形成少许拖尾的假阳性结果。反之，电压或电流过小，受损伤的细胞不会出现拖尾，而出现假阴性结果。电泳的电压多选用低电压，一般在18~50v，在电泳过程中电泳液的温度应不超过15℃（应在4℃条件下进行），电泳时间多在20~40分钟。4.荧光染色及彗星图象分析：4.1采用DAPI荧光剂染色，质量浓度在1~5μg/ml，用量为10μl。染色15分钟后即可观察，视野中明亮荧光的“彗星”被光照时间一般不易超过2分钟，以免荧光剂快速衰退而不宜继续观察和拍照。4.2彗星的图像分析主要靠肉眼显微镜读片，对DNA损伤程度标准的正确判断是非常重要的。用肉眼观察判断的分级需要通过计算机彗星图象分析加以确定，目前已有彗星电脑分析软件可供使用，如Komet3.0等。整体实验还应在避光条件下进行，以减少光线对DNA的损伤。八、参考文献[1]钱晓薇.重铬酸钾对蚕豆根尖细胞致畸效应的研究[