浙江大学细胞培养绪论专家讲座

PlatformTechnologiesofBiology生物技术平台两根支柱：浙江大学细胞培养绪论专家讲座第1页细胞培养技术&单克隆抗体技术浙江大学细胞培养绪论专家讲座第2页细胞培养技术林旭瑷副教授

医学院病原生物学系浙江大学细胞培养绪论专家讲座第3页林旭瑷：

办公室:医学院科研C817

电话:88208294

试验室:科研C804～810

E-mail:lxai122@163.com浙江大学细胞培养绪论专家讲座第4页关于考试：

开卷，试验课结束前上交（10.26-10.27）

（A4纸张打印试题，手写答案附后）

10+40+50浙江大学细胞培养绪论专家讲座第5页参考书谷鸿喜，张凤民，凌虹.细胞培养技术.北京大学医学出版社，章静波.组织和细胞培养技术.人民卫生出版社，谭玉珍.实用细胞培养技术.

高等教育出版社，浙江大学细胞培养绪论专家讲座第6页一、绪论

二、细胞培养基础知识

培养前准备/培养基/培养设备

三、细胞培养基本技术

培养技术/培养物固定、染色/显微镜观察

四、细胞培养中细节问题内容浙江大学细胞培养绪论专家讲座第7页组织培养诞生与发展简史

组织培养优缺点

组织培养惯用术语

组织培养实际意义

细胞系或细胞株命名绪论浙江大学细胞培养绪论专家讲座第8页细胞培养(cellculture)

从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内生理环境，在无菌、适温和丰富营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功效一门技术。细胞培养、组织培养和器官培养浙江大学细胞培养绪论专家讲座第9页将活体一小片组织放在盛有培养液玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长过程。B、组织培养将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养技术。A、细胞培养C、器官培养是指采取一些办法使器官原基、器官一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功效培养技术。浙江大学细胞培养绪论专家讲座第10页一、组织（细胞）培养发展史年鉴1878ClaudeBernard:证实一个器官生理系统在个体死亡以后依然能够人工维持。

1885WilhelmRoux:在一个生理溶液中维持一块鸡胚活性并观察其发育，从而证实该发育与鸡胚其它部分无关。1907RossHarrison:利用凝固青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，并观察到了神经纤维生长，从而处理了神经纤维起源问题。RossHarrison被人称为细胞培养之父。浙江大学细胞培养绪论专家讲座第11页1910Burrows:率先在血浆凝块中长久培养鸡胚细胞。

1911Lewis:以海水、血清、胚胎提取物、盐和蛋白胨为原料配制成了第一个人工细胞培养液，并观察到了单层细胞有限生长。

1916Rous&Jones:开创用胰酶来收获贴壁生长细胞。

1923-1931Carrel:研制T型培养瓶大规模培养细胞。1927Carrel&Rivera:制造了第一个病毒疫苗——牛痘疫苗。1933Gey:创造了转管培养细胞技术。一、组织（细胞）培养发展史年鉴浙江大学细胞培养绪论专家讲座第12页1948Fisher:研制成了第一个化学成份清楚细胞培养液CMRL1006。1952Gey和同事:分离培养了HeLa细胞。1952Dulbecco:创造了噬斑法，用长满单层细胞检测病毒。1954Abercrombie:观察到了体外培养细胞接触抑制现象。1961Hatflick&Moorhead:发觉人成纤维细胞在一定代数之后会死亡。1965Ham:配制了第一个无血清培养液。1975KÖhler&Milstein:成功得到第一个用于单抗生产杂交瘤细胞株。一、组织（细胞）培养发展史年鉴浙江大学细胞培养绪论专家讲座第13页1.研究对象是活细胞

能长时间、直接观察、研究活细胞形态、结构、生命活动等二、细胞培养优点2.研究条件能够人为控制

选择对象：均一性、重复性（类型/性质/阶段）调整条件：化学、物理、生物等原因条件研究方法：各种研究技术、统计方法浙江大学细胞培养绪论专家讲座第14页3.研究范围比较广泛

学科多：细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等对象广：各种动物：低等动物--高等动物--人类

一个动物：不一样年纪--

不一样组织：正常或异常（肿瘤--）二、细胞培养优点4.研究费用相对较经济

可提供大量、同一时期、重复性好、生物学性状相同试验对象浙江大学细胞培养绪论专家讲座第15页

人工所模拟条件与体内实际情况仍不完全相同。当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡环境中久了，必定发生改变。

1.与体内主要不一样

相对孤立、单一

缺乏体内系统作用、失去神经体液调整和细胞相互间影响

2.主要表现

失去原有组织结构和细胞形态

分化减弱或不显著,

细胞趋向单一化二、细胞培养缺点浙江大学细胞培养绪论专家讲座第16页对于体外培养细胞，应该把他们视作一个既能保持动物体内原细胞一定性状、结构和功效又含有一些改变特定细胞群体，而不能将之与体内细胞完全等同。提示浙江大学细胞培养绪论专家讲座第17页三、惯用术语浙江大学细胞培养绪论专家讲座第18页初代培养/原代培养（primaryculture）

从直接取自生物体细胞、组织或器官开始培养。初代培养物一旦进行传代培养后，就成为细胞系。通常10代以内培养物用作原代培养。--有限细胞系（finitecellline）生存期有限细胞系，不能继续传代或传代数有限。--连续细胞系或无限细胞系（infinitecellline）获无限繁殖能力能连续生存细胞系，能连续传代。传代培养（sub-culture）

不论是否稀释，在体外培养条件下，将细胞从一个培养器皿转移至另一培养器皿。浙江大学细胞培养绪论专家讲座第19页贴壁培养（anchorage-dependentculture）

细胞或培养物只有贴附于不起化学作用物体（玻璃或塑料等无活性物体）表面时才能生长、生存或维持功效。不能表明细胞属于正常或恶性转化悬浮培养（suspensionculture）

细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖一个培养方式。淋巴细胞、血液肿瘤细胞等浙江大学细胞培养绪论专家讲座第20页细胞株（cellstrain）

经过筛选或克隆化从原代培养物或细胞系中取得含有特殊性质或标志细胞。这些特征（有一定标识染色体、特殊抗原性等）在以后培养中必须连续存在。

--有限细胞株（finitecellline）

生存期有限细胞株。不能继续传代或传代数有限--连续细胞株或无限细胞株（infinitecellline）

已获无限繁殖能力能连续生存细胞株。能连续传代。亚株（substrain）

由原细胞株深入分离培养出与原株性状有一定不一样细胞群浙江大学细胞培养绪论专家讲座第21页二倍体细胞系或株

细胞群染色体数目含有与原供体二倍体细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％以上）细胞群。在正常情况下含有限生命期，属有限细胞系。

随供体年纪和组织起源不一样，寿命长短各异。---人胚肺成纤维细胞可传40-60代---人胚肾细胞只有8-10代---人胚神经胶质细胞15-30代为保持二倍体细胞能长久被利用，普通在初代或2-5代即大量冻存作为原种（stockcells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长久使用或延缓细胞衰老。假二倍体：仅数目相同，而核型不一样，即染色体形态有改变者。浙江大学细胞培养绪论专家讲座第22页遗传缺点细胞系或株

从有先天遗传缺点者取材（主要为成纤维细胞）培养细胞，或用人工方法诱发突变细胞，都属遗传缺点细胞。

这类细胞可能含有二倍体核型，也可呈异倍体。肿瘤细胞系或株

是现有细胞系或细胞株中最多一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并含有不死性和异体接种致瘤性。浙江大学细胞培养绪论专家讲座第23页细胞凋亡（apoptosis）

细胞内死亡程序开启而造成细胞自杀过程。与机体正常发育、形态形成、消除多出细胞等生理过程亲密相关。主要形态特征为细胞皱缩、染色质聚集与周围化，以及凋亡小体形成。ATCC（Americantypeculturecollection）

美国模式培养物搜集中心/美国菌种保藏中心。除搜集细菌、病毒外，还保藏有大量细胞株（系）。浙江大学细胞培养绪论专家讲座第24页体外转化（invitrotransformation）

细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其它特征可遗传改变，但不含有致瘤性。汇合（confluence）

在瓶中培养细胞彼此汇合形成单层。细胞融合（cellfusion）

在体外培养条件下，经化学试剂（PEG）、病毒（灭活仙台病毒）或物理方法（电脉冲）诱发，使不一样种体细胞融合产生杂交细胞。浙江大学细胞培养绪论专家讲座第25页细胞周期（cellcycle）

细胞从前一次分裂结束开始至此次分裂结束所经历时相过程。DNA合成期（S期）、有丝分裂期（M期）、有丝分裂完成至DNA合成开始间隙期（G1期）、DNA复制结束至有丝分裂开始间隙期（G2期）。群体倍增时间（populationdoublingtime）

在对数生长久进行计算细胞增加一倍所需时间。细胞代时（cellgenerationtime）

单个细胞两次连续分裂时间间隔。浙江大学细胞培养绪论专家讲座第26页群体密度（populationdensity）

培养器皿内，每单位面积或体积中细胞数，多用细胞数/cm2表示。接触抑制（contactinhibition）

当一个贴壁生长体外正常细胞生长至与另一个细胞表面相互接触时，便停顿了分裂增殖，即使相互紧密接触，但不形成交叉重合生长，也不再进入S期。饱和密度（saturationdensity）

在特定条件下，培养皿内能到达最高细胞数，当细胞到达饱和密度后细胞群体停顿繁殖，贴壁培养：细胞数/cm2；悬浮培养：细胞数/cm3。浙江大学细胞培养绪论专家讲座第27页分子生物学生物工程临床诊疗和治疗生物制品药品开发四、细胞培养现实意义浙江大学细胞培养绪论专家讲座第28页单克隆抗体制备过程浙江大学细胞培养绪论专家讲座第29页多莉克隆猴浙江大学细胞培养绪论专家讲座第30页对已建成各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞命名无严格统一要求，大多采取有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，方便记忆和了解

HeLa：为供体患者性名(起源于宫颈癌)CHO：中国地鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary)宫—743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3；美国国立卫生研究所(NationalInstituteofHealth)建立,每3天传代一次，每次接种3×106cell/ml。五、细胞系或细胞株命名浙江大学细胞培养绪论专家讲座第31页已建立细胞系或株签定、管理和使用培养简历：组织起源日期、物种、组织起源、性别、年纪、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等。冻存液：培养基和防冻液名称。细胞活力：融解前后细胞接种存