酶联免疫吸附测定法elisa法

酶联免疫吸附测定法elisa法酶联免疫吸附测定法elisa法第1页

复杂生物体系中生命物质化学测量是揭示生命奥秘主要伎俩，在食品检验、疾病诊疗和预防过程中也日益凸现其主要作用。

经典化学分析方法（滴定分析、重量分析、简单吸光光度法）是以简单离子或分子为检测对象常量或微量分析，面对生物体系成份复杂且待测物浓度较低测试条件则往往无能为力。

于是，一系列针对生物体系中化学成份测量方法应运而生。免疫化学分析即其主要组员，它将免疫学知识与化学分析伎俩有机结合，为生命体系中高特异性、超微量分析提供了处理方法。酶联免疫吸附测定法elisa法第2页

什么是酶联免疫分析技术

ELISA基础原理和方法ELISA种类和改变ELISA特点

ELISA应用实例酶联免疫吸附测定法elisa法第3页

1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA现在已成为当前分析化学领域中前沿课题，它是一个特殊试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)基础上发展起来一个新型免疫测定技术。

酶联免疫吸附测定法elisa法第4页一、基础原理它采取抗原与抗体特异反应将待测物与酶连接，然后经过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定对象能够是抗体也能够是抗原。在这种测定方法中有3种必要试剂：①固相抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标识抗原或抗体（标识物）③酶作用底物（显色剂）酶联免疫吸附测定法elisa法第5页

测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一个抗体（抗原）与酶结合成偶联物（标识物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上抗原（抗体）反应结合后，再加上酶对应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。酶联免疫吸附测定法elisa法第6页

其所生成颜色深浅与欲测抗原（抗体）含量成正比。

这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也能够用分光光度计（酶标仪）加以测定。

其方法简单，方便讯速，特异性强。酶联免疫吸附测定法elisa法第7页二、酶及其底物酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结产物。是ELISA成败关键试剂，它不但含有抗体抗原特异免疫反应，还含有酶促反应，显示出生物放大作用，但不一样酶选取不一样底物，将得到不一样颜色反应.酶联免疫吸附测定法elisa法第8页酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

酶联免疫吸附测定法elisa法第9页ELISA种类和改变

（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕捉法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素ELISA

酶联免疫吸附测定法elisa法第10页（一）双抗体夹心法此法适合用于检验各种蛋白质等大分子抗原酶联免疫吸附测定法elisa法第11页取得待分析物未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留蛋白结合位点洗涤并除去未结合封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其它未结合物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标识抗体复合物彻底洗涤未结合酶标抗体加底物进行酶催化反应依据颜色反应程度进行该抗原定性或定量测定酶联免疫吸附测定法elisa法第12页

间接法是检测抗体最常见方法，其原理为利用酶标识抗抗体以检测已与固相结合受检抗体，故称为间接法。（二）间接法酶联免疫吸附测定法elisa法第13页包被固相载体:用已知抗原包被固相载体加待检标本:使对应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关物质加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合酶标抗抗体加底物显色依据颜色反应程度进行该抗原定性或定量测定酶联免疫吸附测定法elisa法第14页（三）竞争法

此法可用于抗原和半抗原定量测定，也可用于测定抗体。酶联免疫吸附测定法elisa法第15页用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合分别洗涤除去未结合成份加底物显色分别测定两管吸光度值，依据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量酶联免疫吸附测定法elisa法第16页

对照管因为只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合酶标抗原量降低。所以，加入底物后显色反应较弱。酶联免疫吸附测定法elisa法第17页特点一：灵敏性该测定法灵敏度来自作为汇报集团酶。众所周知,酶是一个有机催化剂，极少许酶即可诱导大量催化反应，产生可供观察显色反应现象。所以该体系常被称为酶放大致系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。比如，在测定血清中某一物质含量时，化学比色法敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法敏感度约为5~10μg/ml。

酶联免疫吸附测定法elisa法第18页特点二：特异性其特异性来自抗体或抗原选择性。抗原抗体结合实质上只发生在抗原抗原决定簇与抗体抗原结合位点之间。因为二者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应含有高度特异性。

酶联免疫吸附测定法elisa法第19页

比如乙肝病毒中表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和关键抗体（HBcAg），虽起源于同一病毒，但仅与其对应抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应这种特异性使免疫测定能在一非常复杂蛋白质化合物（比如血清）中测定某一特定物质，而不需先分离待检物。酶联免疫吸附测定法elisa法第20页ELISA应用实例酶联免疫吸附测定法elisa法第21页

饲料中盐酸克伦特罗测定饲料中毒素测定（主要包含黄曲霉毒素，简曲霉毒素）饲料中有害微生物快速筛检（如沙门氏菌）

甲胺磷残留分析甲基对硫磷残留分析呋喃丹残留分析ELISA在饲料安全检测中应用ELISA用于农药残留检测酶联免疫吸附测定法elisa法第22页河豚毒素

植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘

主要有除草剂与杀虫剂两大类比如杀暝松（FN）、甲氟磷酸异已酶（SOMAN）、草不绿（Alachor）、西维因（Carbaryl）、多菌灵及克菌丹（Captan）等。农药检测：酶联免疫吸附测定法elisa法第23页ELISA检测“非经典肺炎”冠状病毒ELISA在结缔组织病早期诊疗中应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体ELISA在疾病诊疗中作用ELISA法检测幽门螺杆菌抗体酶联免疫吸附测定法elisa法第24页ELISA试剂盒商业资讯酶联免疫吸附测定法elisa法第25页ELISA试剂盒酶联免疫吸附测定法elisa法第26页酶联免疫吸附测定法elisa法第27页酶联免疫井酶联免疫吸附测定法elisa法第28页DNM-9602G酶标分析仪DNM-