发酵工程抗生素发酵生产技术概述

韩北忠

中国农业大学食品学院HanBei-zhong,

Prof.PhDCollegeofFoodScience&NutritionalEngineeringChinaAgriculturalUniversity抗生素发酵生产技术AntibioticsFermentationProduction1发酵工程抗生素发酵生产技术概述第1页概述生产前期研究生产菌改良生产工艺过程发酵条件控制提取和精制IntroductionResearchinLabStrainimprovementProductionprocessingFermentationcontrolIsolation&purification抗生素发酵生产技术AntibioticsFermentationProduction2发酵工程抗生素发酵生产技术概述第2页抗生素是生物在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性地抑制或杀灭其它微生物或肿瘤细胞有机物。

Antibiotics

Anyorganicsubstancesproducedbyvariousorganismsthathavethepowerofarrestingthe

growthofothermicroorganismsorofdestroyingthem.1.概述Introduction3发酵工程抗生素发酵生产技术概述第3页历史1929年，英国弗莱明发觉青霉素二战期间，大规模发酵生产世界上最早用于临床抗菌素History

PenicillinwasdiscoveredbyFlemingin1929.WorldWarII,fermentedinlarge-scale

Thefirstmajorantibiotictobecommercialized1.概述Introduction4发酵工程抗生素发酵生产技术概述第4页依据抗生素作用机制分类(ModesofActionofAntibiotics)

抑制细胞壁合成(CellWallSynthesis)

：青霉素抑制细胞膜功效(CellMembraneDamage)

：多烯类抗生素抑制蛋白质合成(ProteinSynthesis)

：四环素抑制核酸合成(NucleicAcidSynthesis)

：丝裂霉素

分类Classification1.概述Introduction5发酵工程抗生素发酵生产技术概述第5页复制翻译转录6发酵工程抗生素发酵生产技术概述第6页依据抗生素化学结构分类β-内酰胺类(β-lactam)：青霉素类(penicillins)

头孢菌素类(cephalosporins)氨基糖苷类(aminoglycosides)：链霉素、庆大霉素大环内酯类(macrolides)：红霉素、麦迪加霉素四环类(tetracyclines)：四环素、土霉素多肽类(polymyxin)：多粘菌素

分类Classification1.概述Introduction7发酵工程抗生素发酵生产技术概述第7页

HNONSCH3CH3HCOO-H-lactamringβ-内酰胺环RnaturalpenicillinR=CH2-CO-8发酵工程抗生素发酵生产技术概述第8页β-内酰胺环9发酵工程抗生素发酵生产技术概述第9页两性霉素Antibioticsare

socomplextheycanonlybesynthesized

inalivingsystem10发酵工程抗生素发酵生产技术概述第10页产生菌筛选抗菌性试验提取、精制、判定毒性试验药理和临床试验ScreeningofastrainAntimicrobialtrialIsolation,purificationandidentificationToxicologicaltrial

Medicinal&clinicaltrial

2．生产前期研究ResearchinLab11发酵工程抗生素发酵生产技术概述第11页

Agardiffusionassayagarplate琼脂培养基lawnoftestbacteria测试菌苔filterpaperssoakedwithtestcompounds含药物滤纸zonesofinhibition(nogrowth)

抑菌圈12发酵工程抗生素发酵生产技术概述第12页分析仪器Analyticalinstruments当代分析仪器：核磁共振毛细管电泳气相色谱高效液相色谱质谱Modernanalyticalinstruments:Nuclearmagneticresonance(NMR)Capillaryelectrophoresis

(CE)Gaschromatography

(GC)Highperformanceliquidchromatography

(HPLC)Massspectroscopy

(MS)

Automation

Sensitivity

Accuracy

自动灵敏准确13发酵工程抗生素发酵生产技术概述第13页人工诱变法：紫外线、X-线、r-线照射亚硝基胍、亚硝酸、秋水仙素、氮芥等诱变剂处理ConventionalstrainselectionPhysicalmutageneg.UltravioletRadiationChemicalmutageneg.Nitrosoguanidine(NTG)Improvedstraincanbeselectedempirically3.抗生素生产菌改良StrainImprovement14发酵工程抗生素发酵生产技术概述第14页基因工程GeneticEngineering

3.抗生素生产菌改良StrainImprovementRecombinantDNATechnology（DNA重组技术）克隆15发酵工程抗生素发酵生产技术概述第15页StrainImprovementScale-upStrain出发菌株Agarplate平板技术PrimaryshakeflaskEvaluation摇瓶培养Secondaryshakeflaskevaluationdifferentmedia二级摇瓶培养各种培养基

Labfermentorevaluation

ProductionCondition小型发酵罐模拟生产条件MastercellbankWorkingcellbankInoculumDevelopment菌种扩大培养PilotplantEvaluation中试生产ProductionEvaluation生产60003003031Possiblerecycle16发酵工程抗生素发酵生产技术概述第16页17发酵工程抗生素发酵生产技术概述第17页Scale-up（比拟放大）modelsELGaddenJr<10dm3GoodproductGoodproductivity>200m3Sameproductivity?Limitations?模拟18发酵工程抗生素发酵生产技术概述第18页摇瓶发酵Shake-flaskfermentation10-50mlin125-500mlflaskBatchonlyLimitedcontrol:temperatureSlowmetabolizingcarbohydrateAmbientpressureBuffersneededtocontrolpHIn-processsamplingdifficultVolumedecreasebyevaporationSolidgrowthonsidewallsAntifoamnotneededAgitationlimited:shakerspeedNocontrolofdissolvedoxygen装液量：10%(~250ml)间歇培养温控受限制代谢碳水化合物慢常压缓冲液控制pH在线取样难容量降低瓶壁上结垢无需消泡搅拌受限制无法控制溶解氧19发酵工程抗生素发酵生产技术概述第19页搅拌罐发酵Stirredtankfermentation10-100,000升容量间歇和补料培养连续控制：pH，温度需要铵盐或氨气2大气压无需缓冲液在线取样易补料,容量增加生长均匀一致需消泡各种搅拌控制溶解氧:通气,加压10-100,000litervesselsBatchandfeedpossibleContinuouscontrol:pH,temperatureAmmoniumsaltsorammonianeededPressureattwoatmospherespossibleNobuffersnecessaryIn-processsamplingeasyVolumeincreasebysugarfeedVeryuniformgrowthAntifoamoftenrequiredWidevarietyofimpellersandbafflesDissolvedoxygencontrolledbyaeration,pressure20发酵工程抗生素发酵生产技术概述第20页摇瓶发酵Shake-flask装液量：10%(~250ml)间歇培养温控受限制代谢碳水化合物慢常压缓冲液控制pH在线取样难容量降低瓶壁上结垢无需消泡搅拌受限制无法控制溶解氧10-100,000升容量间歇和补料培养连续控制：pH，温度需要铵盐或氨气2大气压无需缓冲液在线取样易补料,容量增加生长均匀一致需消泡各种搅拌控制溶解氧:通气,加压搅拌罐发酵Stirredtank21发酵工程抗生素发酵生产技术概述第21页菌种

→种子制备

→发酵

→发酵液预处理→提取及精制→成品包装Strain

→Preparationofseed

→Fermentation

→Treatmentofbroth→Isolation&purification→Packageofproduct4.抗生素生产工艺过程AntibioticsProductionProcessing22发酵工程抗生素发酵生产技术概述第22页Aschemeofthematerialflowinanantibioticproduction23发酵工程抗生素发酵生产技术概述第23页Aschemeofthematerialflowinanantibioticproduction连消发酵罐缓冲罐种子罐24发酵工程抗生素发酵生产技术概述第24页发酵生产原料

MaterialsforFermentationCarbonsource:Beet&canemolassesGlucose,lactose,starchEthanol,methanolGlycerolMaltosesyrup,cornsyrupCottonseedoil,peanutoil,soyoilLardoilMethyloleateTallow碳源:甜菜和甘蔗糖蜜葡萄糖，乳糖，淀粉乙醇，甲醇甘油麦芽糖浆，玉米糖浆绵籽油，花生油，豆油猪油油酸甲酯油脂25发酵工程抗生素发酵生产技术概述第25页氮源:绵籽粉玉米粉和玉米浸出液大豆粉和大豆面花生粉菜籽粉牛血，酪蛋白水解液乳清鱼粉酵母酵母膏肉粉和骨粉

Nitrogensource:CottonseedmealCorn

meal&steepliquorSoybeanmeal&flourPeanutmealRapeseedmealBeefblood,CaseinhydrolysateWheyFishmealWholeyeastYeastextractMeat&bonemeal

发酵生产原料

MaterialsforFermentation26发酵工程抗生素发酵生产技术概述第26页

培养基MediaforCellGrowth&FinalproductionComponentsRange%组成Glucose/sucrose3.0-5.0葡萄糖/蔗糖Starch淀粉3.0-5.0Cornsteepliquor3.0-5.0Calciumcarbonate0.5-1.0碳酸钙Phosphate磷酸盐0.1-0.5Ammoniumsulphate0.1-1.0

硫酸胺Urea尿素0.1-0.5Oil油0.1-0.5Fermentation发酵培养基

ComponentsRange%组成Glucose0.5-1.0Starch

0.5-5.0Cornsteepliquor5.0-8.0玉米浸提液Soyflour1.0-5.0Phosphate0.1-1.0Ammoniumsulphate0.5-1.0andfedperiodicallyOil1.0andfedcontinuouslyCornsyrupfedcontinuously

玉米糖浆连续加料Tankseed种子培养基27发酵工程抗生素发酵生产技术概述第27页StirredtankFermentation搅拌发酵28发酵工程抗生素发酵生产技术概述第28页5.发酵控制FermentationControl

SampleAnalysispHDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationPressureprobeLevelprobepHprobeTbeDOprobeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/Oilfeed29发酵工程抗生素发酵生产技术概述第29页ScaleWeig