可溶性糖、淀粉、蛋白质

植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定一、目的从一份植物样品中系统分离和测定可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质等多种成分，不仅对研究植物体内碳、氮代谢，了解植物的生长发育状况有重要意义，亦可以作为鉴定其品质的重要指标，而且也有助于训练基本操作技能。二、原理（一）分离提取原理在80~85%的乙醇中，植物组织中的还原糖、蔗糖以及游离氨基酸和叶绿素等溶解，而淀粉及蛋白质沉淀，再用9.2mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白质沉淀），最后用0.1mol/L氢氧化钠溶解蛋白质，然后选用适当的方法测定各个提取液中相应物质的含量。（二）测定原理1．蒽酮比色法——可溶性糖含量测定碳水化合物及其衍生物经浓硫酸处理，生成糠醛，再与蒽酮脱水缩合而生成蓝绿色化合物，在一定范围内其颜色深浅与碳水化合物含量成线性关系。蒽酮反应的颜色深浅，随温度条件和加热时间而变化，葡萄糖显色高峰在100°C时，加热lOmin后出现，而核糖在相同温度下，加热3min后出现。此法灵敏度高，糖含量达30pg即可测定。2．茚三酮比色法——氨基酸含量测定氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，产生二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在570nm下有最大光吸收。在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量呈正比。考马斯亮蓝G-250结合法一一蛋白质含量测定考马斯亮蓝在游离状态时呈红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，后者最大光吸收在595nm，在一定范围内（0〜1OOOpg/mL）,其颜色深浅与蛋白质的含量呈正比。此法快速灵敏，反应在2min内即达到平衡，室温lh内颜色稳定，而且干扰物也少。三、实验用品（一） 实验材料：植物样品。（二） 器皿：1.25mL刻度试管X8，15mL试管X20；2.10mL离心管X2；容量瓶：50mLX1，25mLX1；移液管：5mLX2；2mLX4，lmLX2，0.lmLX2；恒温水浴锅；离心机；电子天平；分光光度计。（三）试剂：样品分离提取（1）80%乙醇；（2） 9.2mol/L高氯酸，4.6mol/L高氯酸；（3） O.lmol/L氢氧化钠；可溶性糖及淀粉测定（1） 葡萄糖标准液（100pg/mL）：O.lg无水葡萄糖溶于蒸馏水中，定容至lOOOmL；（2） 硫酸-蔥酮试剂：0.2g蔥酮，lg硫脲（阻氧化剂），缓缓加入100mL浓硫酸，边加边搅拌，溶解后呈黄色透明溶液，贮于棕色瓶中，4C冰箱保存；氨基酸测定（l）60%乙醇；（2）水合茚三酮：1.2g茚三酮，加入30mL正丙醇，搅拌使其溶解，再加入60mL正丁醇和120mL乙二醇，最后加入18mLpH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液混匀，贮于棕色瓶，4°C冰箱保存；乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.4)：乙酸钠54.4g,加入lOOmL蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半，冷却后加30mL冰乙酸，用蒸馏水稀释至lOOmL；标准亮氨酸(5pg/mL)：取80C下烘干的亮氨酸11.7mg,溶解在10%的异丙醇中，并用10%异丙醇稀释至25mL，取5mL，用蒸馏水稀释至50mL；0.1%抗坏血酸：50mg抗坏血酸溶于50mL蒸馏水中。现用现配；4，蛋白质含量测定牛血清蛋白标准液(1000》g/mL)：100mg牛血清蛋白溶于100mL蒸馏水中，贮于4C冰箱；考马斯亮蓝G-250溶液：100mg考马斯亮蓝G-250溶解于50mL95%乙醇中，加入85%(W/V)磷酸100mL，用蒸馏水定容至1000mL。四、操作步骤(一)分离提取(每次离心转速3000〜3500rpm)沉淀弃去（三） 测定1.可溶性糖及淀粉的测定（1）按下表制作标准曲线〜一管号试剂（mL）1234567蒸馏水2.01.81.61.41.21.00.8葡萄糖标准液（100pg/mL）00.20.40.60.81.01.2硫酸-蒽酮5.05.05.05.05.05.05.0加入硫酸-蒽酮试剂时，最好将各管放在冷水中，沿管壁缓缓加入，全部加完后再摇匀。将以上各管在100°C水浴中加热lOmin,取出后用自来水冷却，620nm比色测定。（2）样品测定分别取可溶性糖提取液、淀粉提取液各1mL+1mL蒸馏水（根据含量而定），显色与标准曲线相同。（2）计算样品液总体积（mL）查标准曲线数（pg）X X稀释倍数显色用样液体积可溶性糖%二 X1OO样品重（mg）X1OOO2.淀粉测定吸取上述淀粉提取液2mL（或1mL+1mL水）于大试管中，用测定可溶性糖的方法测定。样品液总体积（mL）查标准曲线数（pg）X0.9X X稀释倍数显色用样液体积淀粉%= X100样品重（mg）X10003．游离氨基酸含量测定1）按下表制作标准曲线管号试剂（mL）123456标准亮氨酸00.20.40.60.81.0蒸馏水2.01.81.61.41.21.0水合茚二酮3.03.03.03.03.03.0抗坏血酸0.10.10.10.10.10.1加完试剂后混匀，置沸水浴加热15min,然后取出放在冷水中迅速冷却并摇动，使加热时形成的红色逐渐被氧化而褪色，直至溶液呈紫色时，用60%的乙醇定容至10mL（可刻度试管），混匀，570nm比色测定。（2）样品测定：吸取上述样品提取液2mL（或1mL+1mL水），显色与标准曲线相同。3）计算样品液总体积（mL）查标准曲线数（pg）X X稀释倍数显色用样液体积X100氨基态氮量（mg/100g干样品）=X100样品重(mg)X10004．蛋白质含量测定（1）按下表制作标准曲线管号试剂（mL）123456蒸馏水1.00.80.60.40.201000pg/mL牛血清白蛋白（mL）00.20.40.60.81.0混匀后，分别准确吸取各管O.lmL至另外6个试管中，加5mL考马斯亮蓝G-