葡萄糖氧化酶法测定血糖浓

葡萄糖氧化酶法测定血糖浓第1页/共23页1.掌握血糖测定原理，计算方法，参考正常值，临床意义。2.了解尿糖的测定及意义。1.收集耳缘静脉血,制备血浆,葡萄糖氧化法比色测定血糖浓度。2.收集尿液,班氏法测定。一.实验要求二.实验内容第2页/共23页血糖（bloodglucose,BG）指血浆（清）中的糖类物质，主要为葡萄糖。一.血糖的来源：食物、糖原的分解、糖异生。二.血糖的去路：有氧氧化、转换成非糖物质、尿排出、糖酵解。血糖第3页/共23页正常血糖浓度:3.9-6.1mmol/L(成年人空腹)低血糖:低于2.8mmol/L高血糖:超过7.8mmol/L2.低血糖的因素：胰岛素、磺脲类药、饮酒、严重饥饿高血糖的因素：进食、情绪紧张时、糖尿病.3.糖尿病的诊断和治疗监视、新生儿低血糖症等.第4页/共23页肾上腺素由肾上腺髓质分泌的一种儿茶酚胺激素。肾上腺素升高血糖机制：在应激状态、内脏神经刺激和低血糖等情况下，肾上腺素被释放入血液循环，促进糖原分解并升高血糖，促进脂肪分解，促进非糖物质向血糖的转化，使血糖浓度增大。肾上腺素adrenaline;epinephrine第5页/共23页一、血糖测定福林-酚试剂法葡萄糖氧化酶法

邻甲苯胺法第6页/共23页葡萄糖氧化酶法原理葡萄糖＋O2＋H2O葡萄糖酸＋H2O2葡萄糖氧化酶（GOD）氧化，37oCH2O2＋苯酚＋4-氨基安替吡啉H2O＋红色醌亚胺

+O237oC辣根过氧化物酶（POD）Trinder反应溶液在505nm下有吸收峰,可用比色法测定,得出葡萄糖的浓度。第7页/共23页标准浓度法A标=KC标LA样=KC样L

C样=A样A标×C标第8页/共23页【试剂】

酶酚混合试剂（PH7.0）

5mmol/L葡萄糖标准应用液

班氏试剂【器材】试管、试管架、吸量管、移液枪、恒温水浴、722型分光光度计。实验前准备【标本】1.血浆应在血液采集1小时内尽早分离。第9页/共23页具体操作（1）称重；（2）取血：

找到耳缘静脉，二甲苯擦拭，涂薄层凡士林（有何作用）。用三棱针刺破耳缘静脉放血(自然血流)，将血液收集于草酸钠抗凝管内（边接边摇,以防凝固），取约5ml。离心，2000rpm，10min，取上清，编号；（3）注射激素后再取血:皮下注射肾上腺素(0.4mg/kg体重)，记录在注射时间。30min后取血5ml于抗凝管内,离心，2000rpm，10min，取上清，编号。第10页/共23页（4）取4支试管，按下表加入试剂:标准(ml)正常(ml)注射后(ml)空白(ml)血清样品葡萄糖标准液蒸馏水酶酚混合试剂–0.02–3.000.02––3.000.02––3.00––0.023.00

将各管充分混匀，37℃水浴中保温15min；取出冷却至室温后，505nm处比色；以空白管调零，读取标准管及测定管光密度值。第11页/共23页计算：

测定管葡萄糖含量（mmol/L）＝测定管光密度

标准管光密度×51.注射前后的血糖浓度2.注射后血糖浓度增高率A肾-A正

A正×100%增高率=第12页/共23页结果记录标准(ml)正常(ml)注射激素后(ml)空白(ml)A血糖浓度增高率第13页/共23页尿糖是指尿中的糖类，主要是指尿中的葡萄糖。正常情况下，肾小管能将肾小球滤过的葡萄糖全部重吸收回血液，当血糖>肾糖阈8.96-10.08mmol/L,超过肾小管的重吸收能力,部分葡萄糖随尿排出。尿糖的测定虽然不能单纯作为糖尿病的诊断标准，但是从某种层面上也能反映一些问题。血浆尿糖尿糖动脉血血细胞、大分子蛋白质等部分水、无机盐、葡萄糖、维生素、尿素等重吸收近端小管二、二、第14页/共23页1.班氏定性试验：2.葡萄糖氧化酶试纸法（干化学法）：反应原理同血糖葡萄糖氧化酶法。尿糖测定第15页/共23页班氏定性试验原理：利用葡萄糖或其它还原性物质在碱性高温环境中，将反应液中Cu2+还原为亚铜离子Cu+，形成黄色的氢氧化亚铜或红色的氧化亚铜。根据显色的程度，可对尿葡萄糖作定性及半定量检测。(CHOH)nCHOCH2OH+2Cu2++4OH-COOH(CHOH)nCH2OH+2CuOH+H2O2CuOHH2O+Cu2O醛糖醛糖酸黄色或红色第16页/共23页

操作步骤20滴班氏剂A尿液2滴B尿液2滴煮沸5min煮沸5min第17页/共23页葡萄糖含量(g/L)试管变化结果符号无糖试剂仍清晰呈蓝色，如有多量尿酸存在也可能少许蓝灰色沉淀—微量0.5以下仅冷却后有少量绿色沉淀+少量0.5~1煮沸约1min后，出现少量黄绿色沉淀++中等量1~2煮沸约15s，即呈土黄色沉淀+++多量2以上开始煮时，即呈多量红棕色沉淀++++第18页/共23页【注意事项】操作到位，取量要准确，吸量管不能混用。血清分离后要及时的测定以免影响实验结果。试剂中含叠氮钠（0.95g/L）为防腐剂。不可入口！避免接触皮肤及粘膜。应采取必要的预防措施使用试剂。第19页/共23页结果分析三.测定的血糖浓度异常：反应不彻底引起的（偏低）葡萄糖标准溶液浓度有问题（偏高或偏低）移液器引起的（偏高或偏低）一.结果可报告范围：本法对葡萄糖的检测范围为0.06～22.2mmol/L。当样品测定值超过上限时，应将样品用9g/L氯化钠溶液作1+4稀释，重新测定，结果乘以5。二.当样品中抗坏血酸浓度≤852µmol/L，胆红素浓度≤684µmol/L，血红蛋白浓度≤2.00g/L，甘油三酯浓度≤22.6mmol/L时没有观察到干扰。第20页/共23页本法测定葡萄糖非常特异，从原理反应式中可知第一步是特异反应，第二步特异性较差。误差往往发生在反应的第二步。一些还原性物质如尿酸、维生素C、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。（1）葡萄糖＋O2＋H2O葡萄糖酸＋H2O2（2）H2O2＋4-氨基安替吡啉＋苯酚H2O＋红色醌式物质过氧化物酶（POD）Trinder反应【讨论】第21页/共23页【思考题】1.为什么要在饥饿条件下采血？血糖主