蛋白质化学一级结构及分析

蛋白质化学一级结构及分析第1页/共94页PeptidesandProteins氨基酸的多聚物，分子量大小差异极大，可以是2或3个到成千上万个氨基酸残基连接而成。两个氨基酸残基之间通过共价的酰胺键（肽键）连接形成一个二肽；三个氨基酸残基连接成三肽；…；有限数量的数十个氨基酸残基连接成寡肽；多个氨基酸残基则连接成多肽；蛋白质可以是成千上万个氨基酸残基连接而成。多肽与蛋白质有时混用，但一般将分子量在10000以下的称为多肽。肽或蛋白质的水解是耗能的，由于高的活化能，水解很慢，蛋白质的肽键非常稳定，多数胞内条件下的半衰期为7年。第2页/共94页肽键就是一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的键缩合水解第3页/共94页

氨基酸连接成肽链后，由于氨基酸之间通过一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合脱水，肽链上的一个氨基酸单位被称为残基（residue），带有游离-氨基的一端被称为氨基（末）端（或N端），带有游离-羧基的一端被称为羧基（末）端（或C端）。H2N-S-G-Y-A-L-COOH第4页/共94页肽链上的解离特性氨基酸形成肽链后，整个肽链上留下N端可解离的氨基、羧基端可解离的羧基、侧链上能够解离的R基团，中间氨基酸的-氨基和-羧基由于形成肽键而不再对整个肽链的解离有贡献。肽也有特征滴定曲线及特征pI。R基团的解离常数由于氨基酸的氨基和羧基被用于形成肽键成为了残基，其解离在一定程度上会发生改变，这种变化受到-氨基及-羧基失去电荷、与其他R基团的作用、其他能够影响解离常数的环境因子有关。第5页/共94页第6页/共94页生物活性的肽及多肽的大小差异极大

不能对生物活性肽及蛋白质的分子量与功能之间作出相关性结论。自然存在的肽的大小从2个到数千个氨基酸残基，甚至最小的肽也能表现出重要的生物学作用，如商业化合成的二肽L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯[人工甜味剂-阿斯巴甜(aspartame)或纽特健康糖（NutraSweet)，比蔗糖甜200倍]。第7页/共94页1965年由科学家James

Schlatter在研究蛋白质时发现，经16年100多次的科学研究及验证后，阿斯巴甜于1981年(FDA批准）以Nutrasweet（纽特健康糖）品牌正式推出市面。1986年我国卫生部批准可用于除罐头以外的所有食品中。第8页/共94页GSH可被氧化成GSSGGSH作用：在红细胞中作为巯基缓冲剂存在；维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原状态。例如，它可防止H2O2将红细胞中血色素的二价铁氧化成三价铁形成高铁血红蛋白。谷胱甘肽Glutathion(e)（GSH）(GSSG)H2N-Glu-Cys-Gly-COOH第9页/共94页蛋白质中多肽链的长度差异极大肌联蛋白第10页/共94页一些小肽在极低浓度下发挥作用一些脊椎动物的激素是小肽，包括催产素（oxytocin）（9个氨基酸残基），由垂体后叶制造，能刺激子宫收缩；舒缓激肽（bradykinin）（9肽）能使呼吸道平滑肌收缩，抑制组织炎症；甲状腺激素释放因子（3肽），下丘脑分泌，能刺激垂体前叶促甲状腺素的释放，它们发挥作用的浓度极低。与许多抗生素一样，一些极毒的毒蘑菇毒素，如鹅膏蕈碱（毒素）(双环的8肽毒素）(amanitin)，对动物有致死作用，与真核生物RNAII聚合酶作用抑制转录。第11页/共94页

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-

Met-脑啡肽Leu-脑啡肽牛催产素牛加压素第12页/共94页鹅膏蕈碱（鹅膏毒素、蝇蕈素）的化学结构第13页/共94页蛋白质可以有不同的多肽亚基一些蛋白质只含有一条简单的多肽链，而另一些蛋白质成为多亚基蛋白质，含有两条或更多条非共价结合的多肽链。多亚基蛋白质的独立的多肽链可以是同一多肽链，也可以是不同的多肽链。有时，不同的亚基形成小的寡聚体(oligomeric)，并以此进一步装配。这种小的寡聚体被称为原体(protomers)，原体再装配成更大的聚集体。如血红蛋白，四条非共价结合的多肽链，两条一致的链和两条相同的链，可以称为四条多肽亚基的四聚体或者原体的二聚体；天冬氨酸氨甲酰磷酸转移酶由6个调节亚基（R）和6个催化亚基（C）组成，装配时先由1个C亚基和1个R亚基组成一个原体CR，再由6个原体装配成一个有活性的酶。第14页/共94页第15页/共94页一些蛋白质的两条或多条

多肽链是共价连接的

胰岛素的两条多肽链通过二硫键共价连接，这种情况下，单条多肽链不是亚基，通常被简单地认为是肽链。因此一条多肽链及共价连接的多肽链不是四级结构。第16页/共94页第17页/共94页从蛋白质的大小估算氨基酸残基数可以从一个不含有其他化学基团的蛋白质分子估算其中的氨基酸残基的大概数目，用蛋白质的分子量除以110，即为组成氨基酸的数目。20种氨基酸的平均分子量为138，较小的氨基酸在多数蛋白质中的丰度高，如果考虑不同氨基酸在蛋白质中出现的比例，平均分子量只有128，形成肽键时失去一分子水（18），因此，蛋白质分子中氨基酸残基的平均分子量为128-18=110。第18页/共94页多肽具有特征性的氨基酸组成，多肽或蛋白质以酸水解产生游离-氨基酸的混合物。当完全水解时，每一种类型的蛋白质产生一种特征性的氨基酸比例或混合物。20种氨基酸几乎从不以相同的比例出现在一个蛋白质中，有高有低，甚至有的只出现一次或根本不出现。第19页/共94页有些蛋白质含有非氨基酸的化学基团

很多蛋白质，如核糖核苷酸酶、胰凝乳蛋白酶，仅含有氨基酸残基，没有其他化学基团-单纯蛋白质。但有些蛋白质，除氨基酸残基外，还含有永久连接的化学组成，被称为复合蛋白质，非氨基酸连接的化学基团被称为辅基(prostheticgroup)。复合蛋白质的分类根据辅基的化学特性，如脂蛋白含有脂、糖蛋白含有糖、金属蛋白含有特异的金属。有些蛋白质甚至含有不止一种辅基，辅基通常对蛋白质的功能起重要作用。第20页/共94页铁蛋白酪蛋白质体蓝素第21页/共94页肽的物理化学性质肽末端α-羧基pKa值比游离AA中的大，而肽末端α-氨基pKa值比游离AA中的小，侧链R基的差别不大。等电点（两性）。酸碱性质取决于：

α-羧基、α-氨基、侧链基团的解离具有双缩脲(biuret)反应(H2N-CO-NH-CO-NH2)--Pr特有的反应（与硫酸铜-氢氧化钠溶液产生紫红色或蓝紫色颜色反应，可用于肽和蛋白质定量测定）。第22页/共94页

1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次:

primarystructure

一级结构：氨基酸序列

secondarystructure

二级结构：α螺旋，β折叠

tertiarystructure

三级结构：所有原子空间位置

quarternarystructure

四级结构：蛋白质多聚体

1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和二硫键的位置。介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立的三维结构的实体）这两个层次。

蛋白质的结构层次第23页/共94页第24页/共94页肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连第25页/共94页肽键肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。第26页/共94页肽键平面6个原子处于同一肽键平面上一般C=N双键(0.128nm)肽键的C及N周围三个键角之和均为360°第27页/共94页两个肽平面以一个Cα为中心发生旋转两个肽键平面之间的α-碳原子，可以作为一个旋转点形成二面角(dihedralangle)。二面角的变化，决定着多肽主键在三维空间的排布方式，是形成不同蛋白质构象的基础。第28页/共94页二面角(DihedralAngle)

绕Cα-N键轴旋转的二面角（C-N-Cα-C）称为φ，绕Cα-C键轴旋转的二面角（N-Cα-C-N）称为ψ，原则上φ和ψ可以取-180°~+180°之间的任一值，这样多肽链主链的各种可能构象都可用φ和ψ这两个二面角或扭角来描述。第29页/共94页研究蛋白质的一级结构，就是要将氨基酸的排列顺序搞清楚。二十世纪四十年代起，许多人不遗余力地从事蛋白质的一级结构研究，Sanger第一个将一个蛋白质（胰岛素）的所有氨基酸的排列顺序通过高度的实验技巧加以确定。第30页/共94页蛋白质一级结构的测定第31页/共94页历史上第一个被确定

氨基酸序列的肽（蛋白质）

胰岛素

insulin第32页/共94页胰岛素的历史

第一个生化药物最小的蛋白质，由A链(21AA)和B链(30AA)组成；胰腺ß细胞分泌的一种激素，告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+；1921年Banting&Best从胰腺中抽提出了有活性的胰岛素，1923年Banting&Macleod获Nobel医学奖；1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素的一级结构，1958年获得Nobel化学奖；1981年，Berg（因DNA重组技术得奖）在大肠杆菌中表达了人胰岛素。第33页/共94页科学怪才FredrickSangerFrederickSanger(1918-)isaBritishmolecularbiologistwhowasworkingonproblemsrelatedtothedeterminationofthestructureofproteins.Hisstudiesresultedinthedeterminationofthestructureofinsulinin1953;forthisdiscoveryhereceivedNobelPrizeinChemistryin1958.In1965,hedevelopedthechainterminationmethod,alsoknownasthe"Sangermethod."HelaterreceivedanotherNobelPrizeinChemistryin1980"forcontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids."In1992,theSangerCentreinCambridge,namedafterFrederickSanger,wasfoundedbytheWellcomeTrustandtheBritishMedicalResearchCouncil,thepurposeofwhichisstatedontheirwebsiteas“toprovideamajorfocusintheUKformappingandsequencingthehumangenome,andgenomesofotherorganisms."两获诺贝尔奖（仅4人），唯一两获诺贝尔化学奖。第34页/共94页Sanger试剂(FDNB)标记N末端第35页/共94页ABCDE↓*ABCDE↓*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE↓*A,*A+B,……*A+B+C+D+E↓*A,*A+*B,……*A+*B+*C+*D+*E

12345

结论：ABCDEFDNBFDNB完全水解部分水解第36页/共94页纸层析、薄层层析帮助确定氨基酸种类第37页/共94页最终靠重叠法确定整个肽链

－－－－－－－－－－－－－多肽↓→→→→→→→→→

→→→→→→

↓→→→→

氨基酸序列第38页/共94页历史上第一个被确定

氨基酸序列的酶（1960年）

核糖核酸酶

ribonuclease,124AA第39页/共94页第40页/共94页Moore&Stein氨基酸自动分析仪Edman降解法Sanger法1958年设计获1972年诺贝尔化学奖第41页/共94页全自动氨基酸分析仪氨基酸分析仪是进行氨基酸分离、衍生和检测的自动化分析系统，广泛用于制药、食品、饲料、农业、育种、医学研究、临床诊断和地质考察等领域。原理：阳离子交换分离、柱后茚三酮衍生、可见光光度法测定。第42页/共94页蛋白质一级结构

的经典分析方法第43页/共94页第44页/共94页1.样品必需纯（>97%以上）；2.测定蛋白质的分子量；3.测定蛋白质由几个亚基组成；4.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。5.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。测定蛋白质一级结构的要求第45页/共94页蛋白质和多肽氨基酸顺序的测定(1)、肽链的拆开和分离

(2)、测定蛋白质分子中多肽链的数目

(3)、二硫键的断裂

(4)、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比

(5)、N端、C端的测定

(6)、多肽链断裂

(7)、测定每个肽段的氨基酸顺序

(8)、确定肽段在多肽链中的次序

(9)、确定原多肽链中二硫键的位置第46页/共94页测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比。第47页/共94页多肽链的拆分由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。第48页/共94页第49页/共94页测定蛋白质分子中多肽链的数目

通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。第50页/共94页蛋白质的酸水解常用6mol/L

HCl或4mol/L

H2SO4在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是Trp被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如Ser或Thr有一小部分被分解；Asn和Gln侧链的酰胺基被水解成了羧基。第51页/共94页蛋白质的碱水解一般用5mol/LNaOH煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是Trp在水解中不受破坏。第52页/共94页蛋白质的酶法水解目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolyticenzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。内切酶：胰蛋白酶、胰凝乳（糜）蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶第53页/共94页颌下腺蛋白酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶金黄色葡萄球菌V8蛋白酶Asp-N-内切酶胃蛋白酶溴化氰第54页/共94页胰蛋白酶（trypsin）R1=Lys（K）和Arg（R）专一性较强，水解速度快R2=Pro（抑制）水解位点第55页/共94页胃蛋白酶（pepsin）R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快R1=Pro（抑制）pH2第56页/共94页糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解位点R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制）pH8-9第57页/共94页嗜热菌蛋白酶（thermolysin)R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快。R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解水解位点第58页/共94页肽键的专一性水解(化学法)化学法:（1）BrCN-Met的C端第59页/共94页

（2）NH2OH（羟胺）断裂：较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键

Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂

第60页/共94页末端氨基酸的测定多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(carboxyl-terminal)。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端：1、Sanger法2、Edman法3、DNS-Cl4、酶降解法C末端：1、肼解法2、酶降解法3、硼氢化锂法第61页/共94页二硫键的断裂

几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。第62页/共94页二硫键的切割与保护1、过甲酸〔performicacid〕

不可逆，巯基被氧化为－CH2SO3H2、还原＋氧化

不可逆

[巯基乙醇，DTT]＋碘乙酸等－S-CH2-COOH3、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕可逆－R1-S-S-R2

＋HSO3-R1-S-SO3H+R2-S-SO3H第63页/共94页巯基（-SH）的保护苯乙酰氯/碘乙酰胺第64页/共94页多肽链断裂成多个肽段

可采用两种或多种不同的断裂方法(如酶解、化学断裂等）将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。第65页/共94页测定每个肽段的氨基酸顺序第66页/共94页肽段的的分离纯化：

凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法。第67页/共94页一级结构分析的经典三步曲第68页/共94页蛋白质一级结构测定的步骤1、蛋白质的分离纯化

Purification2、二硫键的拆分与保护

S-Scleavage&blocking3、(亚基分离）

Subunitseparation4、多种方法的部分水解

Partialhydrolysis5、分离水解后得到的多肽

Peptideseparation6、测序

Sequencing7、重叠

Overlapping8、二硫键位置的确定

Disulfidebondpo.第69页/共94页Cys容易引起的问题1、Cys受空气氧化而形成Cys-Cys2、Cys和Cys-Cys会发生交换反应3、分析氨基酸组成时，Cys容易受修饰而不利于定量4、S-S键使蛋白酶难于作用5、Edman反应中不能形成稳定的PTH-AA6、多条肽链以S-S键相连，拥有两个以上N末端，无法用Edman法测序第70页/共94页N端的测定方法1、Sanger法2、Edman法3、Dansylchloride/Edman法4、酶降解法第71页/共94页Edman降解法(I)DABITC：有色Edman试剂在Edman试剂上加发色基团pH9CF3COOH/无水DABITC:4-N,N-二甲氨基偶氮苯－4'－乙内酰硫脲第72页/共94页Edman降解法(II)第73页/共94页无冕英雄PehrVictorEdman

瑞典人,1916.4.14-1977.3.191946-47年在美国留学时想到改进1930

年Abderhalden&Brockmann发明的

PITC试剂的反应,50年发明Edmandegradation反应.

ActaChemScand4:283(1950)1957年移居墨尔本,远离国际学术中心开始过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个氨基酸的速度;他坚持不申请专利,给了美国公司得以随便开发仪器的方便。1972年到德国，1977年因脑瘤过世。由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测,只有HPLC和相应的紫外检测手段进步后才得到普及;60年代后期Moore&Stein利用该反应测定了RNase的一级结构,遗憾的是Edman没有和他们分享Nobel化学奖.第74页/共94页氨基酸的鉴定、分离纯化PTH-AA第75页/共94页Edman降解与DNS-Cl法的结合¤¤¤第76页/共94页其他序列测定法Dicarboxypeptidase(DCP)法

序列

ABCDEFGHIJK---

酶解

AB，CD，EF，GH，IJ，K－

Edman循环后再酶解

BC，DE，FG，HI，JK，---质谱法第77页/共94页质谱法

Edman循环后看分子量的变化第78页/共94页1、肼法2、3H标记法3、酶降解法4、PFPA/PFPAA法C端的测定方法第79页/共94页蛋白质与无水肼加热

-------NH-CH-CONH-CH-COOH

|

|

Rx

Ry

--+--+NH-CH-CONH-NH2

+

NH2-CH-COOH

|

|

Rx

Ry肼(hydrazine)法测定＋NH2NH2，100℃，5～10h溶于有机溶剂而被除去多种方法确定第80页/共94页蛋白质＋吡啶/3H2O/醋酸酐（3:1:3,v/v）

蛋白质C末端Cα原子会被3H置换C端的氚[3H]标记法测定室温1～2h第81页/共94页

利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase)将肽链的氨基酸从N端

(氨肽酶，aminopeptidase)或C端

(羧肽酶，carboxypeptidase)一个接一个游离出来，

在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序。酶解法末端测序第82页/共94页PFPA：pentafluoropropionicacid

C2F5COOHPFPAA：pentafluoropropionicacidanhydrideC2F5-COOOC-C2F5

这两种物质在酸性条件下低温反应，可以从C端一个接一个地切除氨基酸，与质谱相结合就可以确定C端多个氨基酸的序列。1.Eur.J.Biochem.206,691-696(1992)2.ChemistryLetters,235-238(1992)PFPA和PFPAA法C端测序第83页/共94页二硫键位置的确定

如果蛋白质分子中存在链间或链内二硫键，在多肽链的氨基酸顺序分析后，需要对二硫键的位置加以确定。确定二硫键的位置一般采用胃蛋白酶水解