基因工程导论G课件

第十七章基因工程导论自然界的基因转移和重组基因重组(geneticrecombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译。自然界的基因转移和重组是无目的基因工程有目的接合作用质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）转化作用transformation

通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程第一节基因工程的诞生

一、基因工程的技术准备基因工程技术的诞生不仅依赖于基因分子生物学理论的发展，同时也有赖于一些重要的分子生物学研究方法的建立。最重要的技术准备是限制性酶的分离纯化、DNA连接酶的分离、大肠杆菌转化技术的突破。到1970年，这三大技术都已经建立，“万事齐备，只欠东风”了。到了1972～1973年，两位科学助产士Berg和Cohen将基因工程接到了人间。二、基因工程技术的诞生

第一个重组体的构建

1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”，标志着基因工程技术的诞生。

SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为450Å的球形病毒，分子量为28×106道尔顿。SV40的DNA是环状双链结构，全长5243个碱基对。SV40DNA上有一个限制性内切酶EcoRⅠ的切点。SV40病毒◆当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。◆于是他们进行第二步的实验就是从λdvgalDNA中制备含有E.coli的半乳糖操纵子DNA，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功。BoyerandCohen三、基因工程大事记1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物

1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用

1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼

1993

基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11公布人类基因组基本信息

基因工程(geneengineering)又称基因操作(genemanipulation),重组DNA(recombinantDNA)。基因工程是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段,将不同来源的基因(DNA分子),按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子,然后导入活细胞,以改变生物原有的遗传特性,获得新品种,生产新产品,或是研究基因的结构和功能。第二节基因工程的原理和一般方法基因克隆示意图二、重组DNA或基因工程的主要内容基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：①载体和目的基因的分离；②载体和目的基因的切断；③载体和目的基因的重组；④重组DNA的转化和扩增；⑤重组DNA的筛选和鉴定。

一）基因工程中常用的工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基一把特殊的剪刀

—限制性内切酶的发现

阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖识别和切割位点回文结构4～6bp出现两种末端粘性末端粘端

平头末端平端

同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端限制性内切酶II及其产生的3种不同末端5'突出的粘性末端3'突出的粘性末端平末端EcoRIEcoRVPstIPPPPPP粘性末端平末端同切酶和同粘酶同切酶:识别相同的位点,但生成不同的末端。同粘酶:识别不同的位点,但产生相同的粘性末端。SmaI

5´...CCC^GGG...3´3´...GGG^CCC...5´

XmaI

5´...C^CCGGG...3´3´...GGGCC^C...5´

同切酶BamHI

5´...G^GATCC...3´3´...CCTAG^G...5´BglII5´...A^GATCT...3´3´...TCTAG^A...5´同粘酶Sau3A5´...^GATC...3´3´...CTAG^...5´粘性末端与平头末端其他工具酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶(reversetranscriptase)T4DNA连接酶(T4ligase)碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)末端脱氧核苷酰转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)TaqDNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性5′至3′的聚合活性5′→3′方向核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性polⅠ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段（Klenow片段）：聚合活性、3′→5′外切活性常用的工具酶核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性补齐缺口末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)第三节载体及其构成基本要素能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝粒,端粒方便插入外源片段:单酶切位点选择标记:药物抗性报告基因:插入筛选标记易分离提取高产率（多拷贝）强启动子多宿主常用载体质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬粒(phagemid),病毒，PAC，YAC，BAC特殊用途的载体表达型载体，分泌型载体，穿梭载体宿主繁殖快,易于培养,能够快速得到产物对所携带基因的表达产物具有较高耐受性,具有克隆最多种基因的可能突变率低,能够稳定忠实的保存被克隆基因常用宿主大肠杆菌:繁殖快,易培养,易分离产物噬菌体:转化效率高,易于保存酵母:繁殖最快的真核生物,适于有蛋白质加工的基因表达lacZ常用的克隆载体λ噬菌体(λphage)基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区DNA，替换型载体，外源DNA：9~23kb常用：EMBL系列、λgt系列、charon系列粘性质粒(cosmid)：λDNA的cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：40~50kbM13噬菌体最大优点：产生单链DNA

cos:cohesive-endsite特点：RFDNA:replicationalformDNA优点：表达载体(expressingvector)特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列转录终止序列如何提高克隆效率?提高插入片段和载体的比例尽可能采用粘端连接*载体脱磷以降低载体自连插入片段磷酸化改进转化条件第四节重组DNA技术的基本过程目的基因的制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定一、目的基因(targetDNA)的制备目的基因（外源基因）制备基因组DNA基因文库(genomiclibrary)—存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNAcDNA文库(cDNAlibrary)制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成构建基因库基因库(library)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。核基因库

◆核基因库(genomiclibrary或genomicbank)是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。

◆通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15kb)的DNA片段，与适宜的载体(如EMBL)连接构成重组DNA分子,根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒，噬菌体或cosmid，BAC或YAC等(一)从基因库中分离基因

◆理想的核基因库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总克隆数目少，因此，构建核基因库时常要选择能接受较大片段的载体。◆检测构建的核基因库是否包括一个完整的基因组序列，可用下面的公式计算：

◆例如人类基因组DNA分子量为3.0x106kb,以λEMBL作载体，插入片段的平均长度为17kb，P为99%时构建的基因库应有8.1x105个

重组噬菌体。构建基因库——（1）核基因库见P558P为克隆概率，a为插入片段大小，t基因组总量(2)染色体基因库

◆将基因组的一部分（如一条染色体）用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。◆例如果蝇X染色体上的一个片段，具有50多个多线染色体带(polytene)，利用微切割技术将这一段染色体切割，抽提DNA用限制性酶酶切后，克隆到噬菌体上构建成染色体片段基因库。◆在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分拣技术(flowcytometry)将人类染色体分开后，用于构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。◆在酵母菌中，利用一种改良的脉冲电泳(pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE)方法，将酵母菌的16根染色体据其分子量大小分开后，用于构建染色体库。(3)cDNA库◆cDNA库是以mRNA为模板，经反转录酶(reversetranscriptase)合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)构建的基因库。◆绝大多数真核生物mRNA的3′端具有一段多聚A(poly-A)尾端序列。利用一段多聚T(poly-T)为引物(primer)，与poly-A互补配对，在反转录酶作用下，用poly-T引物引导合成一条互补DNA，即第一条DNA链，结果形成RNA-DNA杂合双链(图9－10)。然后合成第2条链。◆对没有poly-A尾端序列的RNA分子，可用寡聚六苷酸(hexamer)为引物合成第一条链，再用上述方法得到双链DNA。◆得到的双链DNA分子经两端补齐后，以与带有限制性酶切点的人工接头连接，酶切后与载体(通常是λ噬菌体)连接，再制备cDNA库。◆

cDNA库仅具有用于分离mRNA的细胞或组织内表达的基因的mRNA序列，所以它仅包括基因组的部分基因序列。◆在实际工作中，构建什么样的基因库取决于研究目的。cDNA库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。如果要分离在某一细胞或组织高效表达的某种基因，可用该细胞或组织的mRNA构建cDNA库，则很容易得到这个基因。◆通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。(3)cDNA库

2.筛选基因库

◆从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。◆大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。◆如菌斑杂交法(plaquehybridization)筛选λ噬菌体核基因库。◆将经重组噬菌体(来自构建的基因库)感染的宿主细菌细胞与少量上层培养基混合培养，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑。◆再将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，变性，然后用标记的探针(也变性成单链)与膜上的噬菌体DNA杂交，杂交膜用X-光片放射自显影，检测杂交信号。◆凡是与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆。根据杂交信号在膜上的相对位置，定位找出培养皿中所对应的噬菌斑，挑出、培养阳性噬菌斑，制备DNA，用作进一步分析。菌斑杂交法筛选λ噬菌体核基因库3.阳性克隆的分析与鉴定（1）限制性酶图谱◆构建阳性克隆的限制性酶图谱常是分析阳性克隆的第一步。根据同源性分析，可以了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置，用于进一步亚克隆(subcloning)或同已知的其它序列比较。◆一个15kbDNA片段的限制性酶图谱构建方法。★实验过程：首先将阳性克隆DNA分装在3个管中，分别用不同的酶及酶的组合酶切DNA。酶切的产物用于琼脂糖凝胶电泳，染色，在紫外灯下就可见到DNA带。各条带的分子量大小可根据分子量标记估测。★结果分析●从凝胶电泳结果可见，用NotⅠ酶切产生二条带，用SalⅠ酶切也产生二条带。根据模式Ⅱ预计的三个片段长度与实验结果一致，因此模式Ⅱ就是这个15kbDNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。●采用类似的方法，将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。（1）限制性酶图谱

◆采用类似的方法，可将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。◆此外，上述经NotⅠ或SalⅠ消化的片段，可以亚克隆到pUC18等质粒上，进一步用于限制性图谱分析或序列测定。（1）限制性酶图谱（2）核酸分子杂交——Southern杂交(Southernblotting)◆将DNA用限制性酶酶切→酶切DNA电泳→变性→转移到膜上→经过标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交→洗去膜上非特异性结合的探针→检测杂交信号。◆如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，就会检测到杂交带信号。在筛选基因库得到阳性克隆后，往往是将限制性酶酶切与Southern杂交结合起来，绘制限制性酶图谱。◆SOUTHERN.EXE（2）核酸分子杂交——Southern杂交(Southernblotting)（4）核酸序列分析◆测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进一步分析，才能最后得出结论。●同源性比较。可将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较，或将得到的序列发到BLAST等DNAData库的网址上比较，明确测得的序列与所有的已知序列之间的同源程度。●分析核酸序列的阅读框架。一个ORF就是一段能编码一条多肽链，并通常具有翻译起始信号以及一种终止信号的核苷酸序列。◆对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能性研究。(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因

◆聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是体外快速扩增DNA的方法。

◆

PCR反应包括三个步骤：

●变性：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。

●复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60℃

●延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互补链

◆

这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环。◆PCR.EXE(三)人工合成基因

◆根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。◆例如，首先化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡核苷酸，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重叠序列(图9－16)，再将各个寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一起，经SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)扩增出完整的基因片段。二、载体的选择和制备：λ噬菌体、粘性质粒、pUC系列、M13噬菌体三、DNA分子的体外连接（DNA连接酶）粘性末端连接连接效率高相同酶切末端平端连接连接效率低人工接头(linker)法同聚物接尾法同聚物接尾法四、将外源DNA导入宿主细胞基因工程菌HB101,JM109转化(transformation)制备感受态细胞冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态感染(infaction)转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。五、目的基因的筛选和鉴定(screening/selection)遗传学方法插入灭活法(insertioninactivation):抗药性标志选择

标志补救表达产物与营养缺陷互补

α-互补蓝白斑筛选免疫学方法分子杂交探针原位杂交

PCR限制性酶切图谱

IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

六、克隆基因的表达载体有转录、翻译的元件；密码子通用原核表达体系

原核表达载体的标准合适的筛选标志强启动子翻译控制序列多克隆位点第五节基因工程的应用

(一)基因工程工业(二)植物基因工程(三)转基因动物(四)遗传疾病诊断(一)基因工程药物◆胰岛素的人工生产(二)植物基因工程根癌农杆菌介导的植物转化◆植物基因转化：是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。◆根癌农杆菌介导的植物转化2.基因枪转化技术◆通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导入受体细胞，并整合到染色体上的方法。◆此法已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。(三)转基因动物

与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。

◆例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。◆将人的抗胰蛋白酶α-1基因克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达，使羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶；◆可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的重要蛋白质。大象的生长基因转到猪身上(四)遗传疾病诊断(五)基因治疗◆利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病的方法，通常叫做基因治疗(genetherapy)。◆目前最常用的基因转移治疗方法是利用减毒的病毒DNA作载体，构建重组DNA分子，用病毒包装物包装后形成的重组减毒病毒感染患者的细胞，将正常基因整合到染色体上。第六节基因组学

◆基因组学(genomics)：是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主要研究生物体全基因组(genome)的分子特征。◆特点：是以基因组为研究单位，而不是以单个基因，◆目标：是认识基因组的结构、功能及进化，弄清基因组包含的全部遗传信息及相互关系，为最终充分合理利用各种有效资源，预防和治疗人类遗传疾病提供科学依据。◆基因组学(genomics)：是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主要研究生物体全基因组(genome)的分子特征。◆特点：是以基因组为研究单位，而不是以单个基因，◆目标：是认识基因组的结构、功能及进化，弄清基因组包含的全部遗传信息及相互关系，为最终充分合理利用各种有效资源，预防和治疗人类遗传疾病提供科学依据。㈠构建基因组的遗传图谱(geneticmap)；㈡构建基因组的物理图谱(physicalmap)；㈢测定基因组DNA的全部序列；㈣构建基因组的转录本图谱；㈤分析基因组的功能。

基因组学的重要组成部分是

基因组计划(genomeproject)大体上可分为：◆人类基因组计划(humangenomeproject，HGP)：◆水稻基因组计划(ricegenomeproject，RGP)◆模式生物基因组计划：如酵母、线虫、果蝇、小鼠、家猪、拟南芥在进行大规模序列测定之前，构建基因组图谱是测定大基因组全部核苷酸序列的重要一环。基因组图谱可作为序列测定中制定测序方案的依据，以便先重后轻地分析基因。有了基因组图谱之后，基因组序列测定可用下列两种方法结合进行：◆克隆连续序列法(clonecontig)，将基因组DNA切割长度为0.1Mb-1Mb的大片段，克隆到YAC或BAC载体上，分别测定单个克隆的序列，再装配、连接成连续的DNA分子。◆定向鸟枪射击法(directedshotgun)，以基因组图谱中的标记为依据，测序、装配和构建不同DNA片段的序列。一基因组图谱的构建

(一)遗传图谱的构建(二)物理图谱的构建一基因组图谱的构建鸟枪射击法(shotgun)基因组序列测定㈠遗传图谱的构建㈡物理图谱的构建一基因组图谱的构建

(一)遗传图谱的构建

图谱标记图谱构建中需要可以鉴别的标记(marker)，在构建遗传图谱中，可用基因和DNA作为标记。(1)基因标记

(2)DNA标记(一)遗传图谱的构建

1.图谱标记图谱构建中需要可以鉴别的标记(marker)，在构建遗传图谱中，可用基因和DNA作为标记。(1)基因标记

基因控制性状的表现，所以也就是利用可以鉴别的形态、生化等表型性状作标记，这与前述的连锁交换中介绍的方法一样。遗传学中最早建立的果蝇连锁图，就是利用控制果蝇眼睛的一些基因作为标记，分析各基因间的连锁关系及遗传距离，绘制出连锁遗传图谱。这些基本原理和方法，仍在现在的基因组遗传图谱构建中广泛应用。(2)DNA标记以DNA为基础的分子标记主要包括（Gupataetal，1999）◆基于杂交的分子标记，如RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism）。◆基于PCR的分子标记，如RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA）、AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism）、SSR(simplesequencerepeats；又称microsatellite)、AFLP(Ampliconfragmentlengthpolymorphism)等。◆基于DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（singlenucleotidepolymorphism）。

RFLPRFLP技术是基于Southern杂交的分子标记的方法。它是指用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA后，酶切片段长度的差异。这一技术用放射性同位素标记DNA片段作为同源序列探针（RFLP标记），与经限制酶消化并转移到支持膜上的基因组总DNA杂交，通过放射性自显影（或非同位素技术）来显示酶切片段的大小，检测不同遗传位点的多态性RAPDRAPD由Williams等（1990）和Welsh等（1990）分别发展起来的分子标记技术。这一技术是以基因组DNA为模板，采用随机设计的单个寡核甘酸序列（一般为10bp）为引物，通过PCR扩增，产生不连续的DNA产物，用于检测DNA序列的多态性。SSR或微卫星■重复序列：◆串联重复序列（tandemrepeatedsequence），其重复单位首尾相连，成串排列（Flavell1986）。◆散布重复序列（interspersedrepeatedsequence），其重复单位与其它无关序列或单拷贝序列相间排列。■微卫星DNA序列又称简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR）、短串联重复序列（shortsequencerepeat，STR），它是由几个核甘酸（一般1~5个）为重复单位簇集而成的串联重复序列，可分布在整个基因组的不同位置上，而且在基因组中的分布是随机的。微卫星长度具有高度变异性，并且这种多态性常常表现复等位性，两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，因而可以根据两端的序列设计一对特异引物，扩增每个位点的微卫星序列，从而揭示其长度的多态性（simplesequencelengthpolymorphism，SSLP）。ISSRISSR是一种新型的分子标记。与SSR相反，直接用同位素标记SSR序列，扩增2个SSR间的单拷贝序列。为了增加扩增的特异性，在引物的5′和3′端分别加入1～2个选择性碱基，引物长度16～18bp。AFLPAFLP是由荷兰KeyGene公司Zabeau（1992）发现，并由Vos等（1995）发展起来的分子标记技术，结合了RFLP和RAPD技术的优点。AFLP的基本原理是基于PCR的扩增基因组DNA限制性片段多态性。基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头（adapter）连接到DNA片段的末端，通过选择在3′端分别添加1～3个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段并与之结合，从而实现特异扩增。ESTEST（expressedsequencetags）是长约300~400bp的基因表达序列片段。EST技术是将mRNA反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克隆，对其5′或3′端进行一步法测序，所获序列与基因数据库中已知序列进行比较，从而获得对生物体生长、发育、代谢、繁殖、衰落死亡等一系列生理生化过程认识的技术（Hatey1998）。SNPSNP是基因中的点突变，存在的数量多，其中有些可产生RFLP，但多数突变不是发生在酶切位点。人类基因组的编码基因中有20万个SNPs,在非编码区的数目可能还要多10倍以上。这种标记也只有两种等位基因。特性RFLPRAPDSSRISSRAFLP分布普遍存在普遍存在普遍存在普遍存在普遍存在遗传共显性多数显性共显性多数显性多数显性多态性中高高高非常高等位检测是不是是不是不是检测位点数1~31~101~50~50~更多20~100样品信息量低~中高高高非常高基因组区域底拷贝编码整个基因组整个基因组整个基因组整个基因组技术难度中等简单简单简单中等重复性高中等高高高DNA样品量2~30μg1~100ng50-100ng2~50ng100ng反射线一般是不是不是不是一般是耗费时间慢快快快中等可靠性高中等高高高2.遗传图谱的构建（1）人类基因组遗传图谱的构建◆人类的遗传图谱是利用家系分析法，在对8个家系的134个成员的分析中(186个减数分裂)，主要根据5264个STR标记绘制而成的。因为STR在每一百万个碱基中总有几个位点，而且每一个STR具有多个等位基因位点。利用这些家系的资料绘制第1至22号染色体图谱。对于X染色体图谱，还利用了来自另外12个家系，170个成员(105个减数分裂)的资料绘制而成。最后，将5264个标记定位在2335个位点，因为其中有些标记相距很近而作为一个位点，所以位点数小于标记数目。(二)物理图谱的构建拟南芥人类部分染色体物理图谱E.coli物理图谱二基因组图谱的应用

◆基因定位借助基因组图谱，可使基因定位在精度、速度、广度等方面有极大的提高，在复杂的数量性状位点(quantitativetraitloci，QTL)定位分析方面，也取得了很大进展。◆基因组比较分析已经在禾本科，茄科，十字花科等做了遗传图谱比较分析，从分子水平了解物种间的同源性，研究基因组的进化和染色体的演变。◆标记辅助选择(marker-assistedselection，MAS)根据图谱间接选择目的基因，大大加速目的基因的转移与利用，提高回交育种的效率。此外，标记辅助选择有助于克服轮回选择过程中早期选择的盲目性。◆