食品发酵工程 11谷氨酸发酵生产

PAGEPAGE1第十一章谷氨酸发酵生产氨基酸的生成方法有合成法和发酵法两种。氨基酸发酵，就是利用微生物的生长和代谢活动生产各种氨基酸的过程。氨基酸发酵是好气性发酵，产品是固体产品，氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵，由发酵所产生的产物——氨基酸都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立在对微生物正常代谢的抑制上的。也就是说，氨基酸发酵的关键取决于其控制机制是否能被解除，能否打破微生物的正常代谢调节，人为地控制发酵。表部分氨基酸及其生产所用菌株氨基酸使用的菌株谷氨酸谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌或黄色短杆菌、北京棒杆菌（AS1.299）或钝齿棒杆菌（AS1.542或B9）缬氨酸北京棒杆菌（AS1.586(ile-)*）、乳糖发酵短杆菌(thr-)DL-丙氨酸凝结芽孢杆菌(Bacilluscuagulans)(met-)脯氨酸链形寇氏杆菌(kurthiacatenoform)(ser-)、黄色短杆菌ile+SGR)*赖氨酸黄色短杆菌(AECR)乳糖发醇短杆菌(AECR+ser-或ECR+Ade-+Gu)、谷氨酸棒杆菌(AECR+Leu或AECR+met或AECR+Ala)苏氨酸大肠杆菌(met-+var)、大肠杆菌W(DAP_+met+ile_)鸟氨酸谷氨酸棒杆菌(Cit_)、黄色短杆菌(Cit-或Arg-)亮氨酸黄色短杆菌(ile-+met-+Tar)酪氨酸谷氨酸棒杆菌(Phe—+Pu－)*营养缺陷型，R：抗性。谷氨酸发酵、赖氨酸发酵、L-天门冬氨酸发酵、苏氨酸发酵、缬氨酸发酵1965年，被国家科委评为重大成果的发酵法生产谷氨酸项目取得成功，是我国氨基酸工业发展史上的一个重要里程碑，替代了此前沿用了40年之久的蛋白质酸水解法。谷氨酸一直是发酵工业的支柱产业，占氨基酸总产量的80％以上，产量以年均17％的速度递增。2004年总产量为114万吨，2005年达到120万吨。谷氨酸的作用：①MSG鲜味剂；②在人体内能与血氨结合生成谷氨酰胺，解除组织代谢过程中所产生的氨毒害作用，可作为治疗肝病的辅助药物；③参与脑蛋白代谢和糖代谢，对改进和维持脑功能有益。④还可以用来治疗神经衰弱以及配制营养注射液等1原料及其处理发酵生产谷氨酸的原料有淀粉质原料：玉米、小麦、甘薯、大米等。其中甘薯和淀粉最为常用；糖蜜原料：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜；氮源料：尿素或氨水。1.1淀粉糖化绝大多数的谷氨酸生产菌都不能直接利用淀粉，因此需先将它水解成葡萄糖。⑴酸解法原料（淀粉、水、盐酸）调浆→糖化→冷却→中和脱色→过滤除杂→糖液调浆：原料淀粉加水调成10－11Bx的淀粉乳，用盐酸调pH1.5左右（盐酸用量约为干淀粉的0.5-0.8%）。糖化：高温高压0.25-0.4MPa，水解10－20min。中和：调pH至4.5-5.0，以便使蛋白质等胶体物质沉淀析出。脱色：活性炭吸附过滤除杂：脱色液沉淀1-2h后过滤除杂。酸水解法水解时DE值＞55时产生异味。⑵酶解法酸解法和酶解法的比较：①酶解法条件温和，不需耐高温高压设备，改善了操作条件；但酶解法需要离子交换等设备；②酶解法一般需48h，操作时对温度和pH要求严格，不如酸解法粗放；③酶解法副反应少，淀粉水解率高，DE值达98％以上，而酸解法为90％；④因为酶法水解淀粉很少发生副反应，所以使用的淀粉乳浓度可以由酸解法的18－20％提高到34－40％；⑤酶解法制成的糖液色泽较浅，质量高。工艺过程：活性炭、离子交换树脂糖化酶糖化保温48h活性炭、离子交换树脂糖化酶糖化保温48h调pH6.0~6.5α-淀粉酶液化80~90℃淀粉浆（30%~50%）液化液（糊精，DE15~20）冷却至55~60℃糖化液（DE95~96）淀粉浆（30%~50%）结晶浓缩固化或喷雾干燥粉状葡萄糖（收得率100%）结晶葡萄糖（得率30%以上）图1葡萄糖生产工艺过程图先用酸解法将淀粉水解成糊精和低聚糖，然后再用糖化酶将酸解产物糖化成葡萄糖。⑷酶酸法先用α-淀粉酶将淀粉水解成糊精，然后再用酸将糊精水解成葡萄糖。1.2糖蜜预处理糖蜜中特别是甘蔗糖蜜中含有过量的生物素，会影响谷氨酸积累，因此需经过预处理以降低生物素的含量。⑴活性炭处理：吸附掉生物素，但此法活性炭用量大，多达糖蜜的30－40%，成本高。⑵水解活性炭处理法：用盐酸水机甘蔗糖蜜，再用活性炭处理的方法去除生物素。⑶树脂处理法：甜菜糖蜜可用非离子化脱色树脂除去生物素，这样可以大大提高谷氨酸对糖的转化率。处理时先用水和盐酸稀释糖蜜，使其浓度达到10％，pH达到2.5，然后在120℃2谷氨酸产生菌目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum，1956年日本人木下等人发现)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)。我国使用的生产菌株是北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinenesen.sp.)AS1.299、北京棒杆菌D110、钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatumn.sp)AS1.542、棒杆菌S-914和黄色短杆菌T6~13（BrevibacteriumflavumT6~13）等。在己报道的谷氨酸产生菌中，除芽孢杆菌外，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有一些共同的特点，如菌体为球形、短杆至棒状、无鞭毛、不运动、不形成芽孢、呈革兰氏阳性、需要生物素、在通气条件下培养产生谷氨酸。3谷氨酸合成途径谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。4发酵工艺味精生产全过程可分五个部分：淀粉水解糖的制取；谷氨酸生产菌种子的扩大培养；谷氨酸发酵；谷氨酸的提取与分离；由谷氨酸制成味精。菌种的扩大培养↓淀粉质原料→糖化→中和、脱色、过滤→培养基调配→接种→发酵→提取(等电点法、离子交换法等)→谷氨酸→谷氨酸-Na→脱色→过滤→干燥→成品4.1培养基成分⑴碳源：碳源是构成菌体和合成谷氨酸的碳架及能量的来源。由于谷氨酸产生菌是异养微生物，因此只能从有机物中获得碳素，而细胞进行合成反应所需要能量也是从氧化分解有机物过程中得到的。实际生产中以淀粉、糖蜜等糖质原料为主，水解后产生葡萄糖。培养基中糖浓度对谷氨酸发酵有密切的关系，在一定的范围内，谷氨酸产量随糖浓度的增加而增加。碳源在谷氨酸产生菌中的作用有三点：①利用葡萄糖经体内代谢转变为核酸、蛋白质等，供菌体生长繁殖所用；②一部分葡萄糖经体内氧化作用产生能量作为菌体生长繁殖以及新陈代谢的能源；③在培养条件适宜的情况下，大部分葡萄糖经EMP-TCA途径转变为α-酮戊二酸，在NH4+和供氧体NADPH2存在时还原氨基化产生谷氨酸，通过细胞渗透到发酵液中。其反应如下：C6H12O6＋NH3＋1.5O2C5H9O4N＋CO2＋3H2O1mol葡萄糖产生1mol谷氨酸，其理论转化率为81.7%。从理论上讲，糖的浓度越大，谷氨酸产量越高，但事实上糖的浓度超过一定限度就不利于细菌细胞的增殖和谷氨酸的合成。例如发酵培养基中糖的浓度在15％以上时细菌仍然可以勉强生存，然而糖－酸转化率却降低；而糖的浓度太低，虽然可以提高转化率，但谷氨酸总产量也低，为了解决这个矛盾，可选育一些耐高糖的菌株。⑵氮源：氮源是合成菌体蛋白质、核酸及谷氨酸的原料。碳氮比对谷氨酸发酵有很大影响。大约85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌体。由于形成谷氨酸不仅需要足够的NH4+存在，而且还需要一部分氨来调节pH，因此谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多得多，一般发酵工业碳氮比为100：0.2~2.0，谷氨酸发酵的碳氮比为100：20~30。当低于这个值时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累很少；当高于这个值时，菌体生长受到一定抑制，产生的谷氨酸进而形成谷氨酰氨，因此只有碳氮比适当，菌体繁殖受到适当的抑制，才能产生大量的谷氨酸，实际生产中一般用尿素或氨水作为氮源并调节pH。⑶无机盐：是微生物维持生命活动不可缺少的物质。其主要功能是：①构成细胞的组成成分；②作为酶的组成成分；③激活或抑制酶的活力；④调节培养基的渗透压；⑤调节培养基的pH；⑥调节培养基的氧化还原电位；⑦起着调节微生物生命活动的作用。发酵时，使用的无机离子有K+、Mg2+、Fe2+、Mn2+等阳离子和PO43－、SO42－、Cl－等阴离子，其用量如下：KH2PO40.05%~0.2%；K2HPO40.05%~0.2%；MgSO4·7H2O0.005%~0.1%;FeSO4·7H2O0.0005%~0.01%；MnSO4·H2O0.0005%~0.005%。⑷生长因子：凡是微生物生命活动不可缺少，而微生物自身又不能合成的微量有机物质都称为生长因子。生长因子通常是指氨基酸、嘌呤、嘧啶和B族维生素如硫氨素。糖质为碳源的谷氨酸产生菌几乎都是生物素缺陷型，也就是说这些细菌本身都不能合成生物素。生物素主要参与细胞膜的代谢，进而影响细胞膜的透性，从而影响谷氨酸菌的生长、繁殖和代谢产物的积累。生长因子含量的多少，与生产有着十分密切的关系。一般亚适量的生物素是谷氨酸积累的必要条件，实际生产中通过添加玉米浆、麸皮、水解液、糖蜜等作为生长因子的来源，来满足谷氨酸产生菌必须的生长因子。4.2培养基⑴斜面培养基葡萄糖0.1%，牛肉膏1.0%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.0%，pH7.0~7.2121℃⑵一级种子、二级种子及发酵培养基一级种子：葡萄糖2.5%尿素0.6%KH2PO40.1%MgSO4.7H2O0.04%玉米浆2.3~3.0mlpH7.0二级种子：水解糖3.0%尿素0.6%玉米浆0.5~0.6mlK2HPO40.1~0.2%MgSO4.7H2O0.04%pH7.0发酵培养基水解糖12~14%尿素0.5~0.8%玉米浆0.6mlMgSO4.7H2O0.06%KCl0.05%Na2HPO40.17%pH7.04.3培养基灭菌谷氨酸发酵培养基（指淀粉水解糖为主要碳源的培养基，以5000L发酵罐为例）实罐灭菌条件是：105-110℃连续灭菌条件：连消塔灭菌温度为110-115℃，维持罐温度在105-110培养基灭菌后冷却至30℃4.4发酵条件的控制⑴温度谷氨酸发酵前期(0~12h)是菌体大量繁殖阶段，在此阶段菌体利用培养基中的营养物质来合成核酸、蛋白质等，供菌体繁殖用，而控制这些合成反应的最适温度均在30~32℃。在发酵中、后期，是谷氨酸大量积累的阶段，而催化谷氨酸合成的谷氨酸脱氢酶的最适温度在32~36⑵pH值发酵液的pH影响微生物的生长和代谢途径。发酵前期如果pH偏低，则菌体生长旺盛，长菌而不产酸；如果pH偏高，则菌体生长缓慢，发酵时间拉长。在发酵前期将pH值控制在7.5~8.0左右较为合适，而在发酵中、后期将pH值控制在7.0~7.6左右对提高谷氨酸产量有利。⑶通风谷氨酸产生菌为兼性好气性微生物，在供氧不足时和供氧充足时均可生长，然而代谢产物有所不同。通风量小时进行不完全氧化，蔗糖进入菌体后经糖酵解途径产生丙酮酸，丙酮酸则经还原产生乳酸；如果通风量大，则进入菌体内的葡萄糖被氧化成丙酮酸后继续形成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环生成α-酮戊二酸。由于供氢体(NADPH2)在氧充足的条件下经呼吸链被氧化成水，而无氢的供给，谷氨酸的合成受阻，α-酮戊二酸大量积累。只有在供氧适当的条件下，还原型辅酶Ⅱ(NADPH2)大部分不经呼吸链氧化成水，在NH4+供应充足的情况下，才能在谷氨酸脱H酶的催化下还原氨基化形成谷氨酸，使谷氨酸大量积累。在谷氨酸发酵过程中，发酵前期以低通风量为宜；发酵中、后期以高通风量为宜。实际生产上，以气体转子流量计来检查通气量，即以每分钟单位体积的通气量表示通风强度。另外发酵罐大小不同，所需搅拌转速与通风量也不同。通风比：如每分钟向1m3的发酵液中通入0.1m3⑷泡沫的控制在发酵过程中由于强烈的通风和菌体代谢产生的CO2，使培养液产生大量的泡沫，不仅使氧在发酵液中的扩散受阻，影响菌体的呼吸和代谢。给发酵带来危害，必须加以消泡。消泡的方法有机械消泡(耙式、离心式、刮板式、蝶式消泡器)和化学消泡(天然油脂如花生油菜油等、聚酯类、醇类、泡敌、硅酮等化学消泡剂)两种方法。天然油脂类的消泡，剂用量较大，一般为发酵液的0.1-0.2%(V/V)，泡敌（聚环氧丙烷甘油醚）的用量为0.02-0.03%(V/V)。⑸发酵时间不同的谷氨酸产生菌对糖的浓度要求也不一样，其发酵时间也有所差异。一般低糖(10%~12%)发酵，其发酵时间为36~38h，中糖(14%)发酵为45h。发酵条件优化：控制最适的环境条件是提高发酵产率的重要条件。在谷氨酸发酵中，应根据菌种特性，控制好生物素、磷、NH4+、pH、氧传递率、排气中CO2和O2含量、氧化还原电位以及温度等，从而控制好菌体增殖与产物形成、能量代谢与产物合成、副产物与主产物的合成关系，使菌体最大限度地利用糖合成产物。在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成