常用中药的生物鉴定pcr

常用中药的生物鉴定pcr常用中药的生物鉴定pcr第1页常见中药生物判定方法免疫判定法电泳判定法生物效价判定法单纯指标判定法细胞生物学判定法DNA遗传标识判定法mRNA差异显示判定法常用中药的生物鉴定pcr第2页聚合酶链式反应

(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一个分子生物学技术，用于放大特定DNA片段。可看作生物体外特殊DNA复制。常用中药的生物鉴定pcr第3页少许DNA样品快速扩增amplify技术。

(inventedbyKaryMullis,wonaNobelPrizeinChemistryin1993)常用中药的生物鉴定pcr第4页原理常用中药的生物鉴定pcr第5页

PCR要件模板Template

引物

Primers:

SmallpiecesofDNA. Madeupof15to30bases.

BindstheDNAataspecificregion. forwardandreverse正向和逆向酶Enzyme:

TaqDNApolymerase

PCR核酸Nucleotides:

Substrate,fourdeoxyribonucleotides(A,C,G,T) dNTP常用中药的生物鉴定pcr第6页MDistH2O 117ul10Xbuffer 15uldNTP 12ulPrimer1 3ulPrimer2 3ulTaqpolymerase 0.75ul200ultubePipette上下混合常用中药的生物鉴定pcr第7页取出15ul剩下加入3ulTemplateDNA用pipette上下混合分装入tube15ul/支标上1…….51234554°C56586062RunPCRTcTc55°C不加模板对照组M

常用中药的生物鉴定pcr第8页加入1ul模板DNA不加引物但有模板对照Pc常用中药的生物鉴定pcr第9页15ulMTC3ultemplate(T)PipettemixTC15ul/tubepcPC123451ultemplateT常用中药的生物鉴定pcr第10页TCPC1234554555657586062oCRNU常用中药的生物鉴定pcr第11页ProgramDenature95°C 5minDenaturation变性：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，普通加热至90－95℃,30secAnnealing褪火：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链，55－70℃，固称其为褪火。mostimportantfactorinthePCR,45secExtension延伸：在Taq酶作用下，以dNTP为原料，从引物5′端→3′端延伸，合成与模板互补DNA链,温度为70－75ºC,1.5minFinalextension72°C,5min常用中药的生物鉴定pcr第12页常用中药的生物鉴定pcr第13页常用中药的生物鉴定pcr第14页常用中药的生物鉴定pcr第15页常用中药的生物鉴定pcr第16页常用中药的生物鉴定pcr第17页常用中药的生物鉴定pcr第18页常用中药的生物鉴定pcr第19页常用中药的生物鉴定pcr第20页常用中药的生物鉴定pcr第21页常用中药的生物鉴定pcr第22页常用中药的生物鉴定pcr第23页常用中药的生物鉴定pcr第24页2x106常用中药的生物鉴定pcr第25页优点:needverysmallamountofsample缺点: amplifiedproductmaybecontaminated withothersamplesnotrelatedtothe one常用中药的生物鉴定pcr第26页FactorsaffecttoPCRMg+2concentration,

Mg+2

specificity

0.1~5mmol/LMg+2预试验Primer(引物)specificityDegenerateprimer---tofindthetargetgeneinthecloselyrelatedspeciesspecificity,nonspecificproducts常用中药的生物鉴定pcr第27页AnnealingTemperature Toohigh noPCRproduct Toolow muchnonspecificproduct gradientTempPCRmachine findthesuitableTempTaqpolymerasequalityTemplate(模板)DNAquality常用中药的生物鉴定pcr第28页PCR产物判定Agarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%AgaroseinTAEbuffer(17ml)boilPourintothetray(assembledgelapparatus)常用中药的生物鉴定pcr第29页常用中药的生物鉴定pcr第30页AfterPCRamplificationAgarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%agarosein17mlTAE(4mmthick)5ulproductadd1ul6Xloadingdyemix1Kbmarker2.5ul100Vrun25-30minEBstain10min(EB致癌物,戴手套),photograph常用中药的生物鉴定pcr第31页1.51.00.50.2Kb10gammaprimerMismatch3base10gammaprimercompletematch常用中药的生物鉴定pcr第32页PCR应用

1.detectiongeneticallymodificationorganism (GMO)检测转基因生物，找出特异基因或片段

find

specificgeneorfragment(promoter)

2.unculturedmicroorganism3.pathogenidentification4.detectioninsertionsequence(cloning)常用中药的生物鉴定pcr第33页提取模板反应体系配置PCR扩增电泳引物设计常用中药的生物鉴定pcr第34页乌梢蛇为《中国药典》(版)一部收载一个常见中药，起源于游蛇科动物乌梢蛇[Zaocysdhumnades(Cantor)]干燥体。有祛风、通络、止痉之功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、半身不遂、抽搐痉挛、瘰疠恶疮。商品流通中多以红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等来混作正品药材进行销售，这些品种多数与乌梢蛇同科不一样属，因其起源相近，造成判定困难。另外，药材在加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上花纹特征、颜色几近消失，难以识别，而且其大小、形态特征与乌梢蛇相近，这是造成其性状判别困难另一主要原因。鉴于乌梢蛇作为中药临床功效确切，但商品起源复杂、药材性状判别困难现实状况，为满足当前市场常见混伪品判别要求，寻找经济实用、准确便捷、稳定性高方法，应用高特异性PCR方法对乌梢蛇药材及其混同品原动物和炮制品进行判别。常用中药的生物鉴定pcr第35页高特异性PCR方法判别乌梢蛇及其混同品常用中药的生物鉴定pcr第36页功效：祛风、通络、止痉。市售混同品：红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等常用中药的生物鉴定pcr第37页乌梢蛇高特异性

PCR判别引物设计从GenBank下载正品原动物乌梢蛇及混伪品线粒体12SrRNA基因序列经DNAMAN软件对位排列分析正、混品间DNA序列差异，设计出一对能特异性扩增乌梢蛇12SrRNA基因片段特异性判别引物HWL-1和HWH-1

（上海生工生物合成企业）常用中药的生物鉴定pcr第38页模板DNA提取

基础要求是除去杂质，并个别纯化标本中核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。所得到粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

常用中药的生物鉴定pcr第39页特异性PCR判别反应体系：

Tris-HCl10mmol/L

氯化钾50mmol/LMg2+1.5mmol/LdNTP0.15μmol/LTaq1U(40ml)

引物0.15μmol/L

模板DNA50ng常用中药的生物鉴定pcr第40页步骤预变性95°C 4min

变性95°C40sec褪火65°C1min延伸72°C30sec延伸72°C5min设置无DNA模板阴性对照通用引物组成阳性对照25cys常用中药的生物鉴定pcr第41页琼脂糖凝胶电泳取5μl反应液经1.8%琼脂糖凝胶电泳EB染色