2014年2015工作文件优宁维学术icc ihc免疫组化知识培训

目录原理实验流程我公司供应试剂

优宁维

原理免疫细胞组织化学：（Immuncytochemistry：ICC&ImmunohistochemistryIHC)对组织切片标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究的技术它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织检测技术。

实验流程

标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件

保持所检标本原有的结构、形态；

在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，

-------既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。

组织标本

-石蜡切片

-冰冻切片

细胞标本

-组织印片

-细胞培养片(细胞爬片)

-细胞涂片

石蜡切片制备冰冻切片制备细胞片制备

石蜡切片

石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法

-最大优点是组织形态保存好,能作连续切片,有利于各种染色对照观察；

-石蜡块还能长期存档，供回顾研究。

-对组织内抗原显现有一定的影响

1取材

2固定及常用的固定液

*取材后的组织需立刻投于固定剂中固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。

常用的固定液4%多聚甲醛：PFA。交联剂，理化性质更稳定最常用交联降低抗原性，10%的甲醛（福尔马林）：NBF。交联剂Ethanol

：易挥发，Methanol

：Acetone

：常用于细胞细胞爬片

Santa冰冻切片固定剂

抗原修复

甲醛类易于抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；

蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。

*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

3、抗原修复——方法

*酶方法-胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05％～0.1％，消化时间为37，10～40min，主要用于细胞内抗原的显示-胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%～0.4％，消化时间为37、30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示

-水浴加热法：

将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。

-微波照射法

将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，*酸水解法

*高压加热法修复液：最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；

1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。

(二)冰冻切片

*冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。

在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。

-缩短了制片时间

-抗原性不受损失

对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。

制备冻块时要求低温、速冻。

冰冻切片不易得到连续性很好的切片其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。

1、冰冻组织块的常用方法*液氮中冰冻：组织投入液氮中(一196℃)中10～20sec；

2、切片

使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25℃。切片厚度一般为4～8um。

3、切片后处理

切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，入4&61616;C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。

(三)组织印片

将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。(四)细胞培养片(细胞爬片)

*贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(丙酮-20℃固定10～20min)，再进行免疫染色。(五)细胞涂片

*大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：

-血液、尿液、脑脊液；体腔积液；组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织、

冷丙酮固定10min

染色过程

酶标抗体法——石蜡切片1标本准备：2石蜡切片抗原修复

0.01MPBST漂洗，5min×3；3封闭内源性过氧化物酶：3％H2O2-甲醇溶液室温孵育5～10min0.01MPBST漂洗，5min×3；

5～10%正常山羊血清(0.01MPBS稀释)封闭，室温孵育30min4

一抗孵育：倾去多余血清，加1％BSA(PBST配制)稀释的一抗

37℃孵育60min或4℃过夜

0.01MPBST漂洗，5min×3；

5加HRP标记的二抗室温孵育lh或37℃30min6加0.01％H2O2~0.05％DAB显色(显色液应新鲜配置)；

7经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。

结果

同一个抗体，同一部位

间接免疫荧光:冰冻切片1标本的处理

冷丙酮或4%的多甲醛固定10min，然后用0.0lMPBST(含0.l%TritonX-100pH7.4)漂洗5min×3/次；2非特异性封闭：

2%BSA或10%BSA37℃湿盒内封闭30min3一抗孵育：

加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37℃作用30min或4℃过夜。0.01MPBST漂洗5min×3次4二抗孵育：

加荧光标记的二抗抗体，37℃湿盒避光作用30min5镜检

0.01MPBST避光漂洗5min×3次甘油缓冲液封片，镜检

IF-F图片DARPP-32(19A3)RabbitmAb(green)

Neurofilament-H(RMdO20)MousemAb#2836(red).Bluepseudocolor=DRAQ5™(fluorescentDNAdye).间接免疫荧光:1标本的处理：

-细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，

0.0lMPBST(含0.l%TritonX-100pH7.4)漂洗5min×3/次；2非特异性封闭：*2%BSA或10%BSA37℃湿盒内封闭30min3一抗染色

加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37℃作用30min或4℃过夜。

0.01MPBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；

4加荧光标记的二抗抗体，37℃避光作用30min。

0.01MPBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；5甘油缓冲液封片6镜检

结果图片用Alexa488标记的抗人α-tubulin抗体染色显示管(绿色);细胞核:红色,DAPI染色(常规荧光显镜照片)用抗α-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核红色,DAPI染色(激光共聚焦显微镜照片)

主要涉及的产品1一抗：2

二抗：酶标、荧光标记、生物素标记3显色试剂盒：碱性磷酸酶底物显色试剂盒(BCIP/NBT)

HRP-DAB底物显色试剂盒

ABC免疫组化试剂盒

各厂家IHC的表示不同厂家不一样：例如：CST4060：表示的最清楚Santa：做石蜡切片会着重标出来。

sc-1156：

Abcam：比较细，同时也复杂

ICC：ImmunocytochemistryICC/IF：Immunocytochemistry/ImmunofluorescenceIF：ImmunofluorescenceIHC：ImmunohistochemistryIHC(Methanolfixed)：Immunohistochemistry(Methanolfixedcells)IHC(PFAfixed)：Immunohisto