人型腺病毒重组六邻体蛋白的纯化及免疫学生

人3型腺病毒重组六邻体蛋白的纯化及免疫学研究Q260046902专业做论文-PAGE42－－哈尔滨医科大学硕士学位论文目录中文摘要……………2英文摘要……………3文献综述……………4前言…………………13实验材料……………15实验方法……………21实验结果……………27讨论…………………32结论…………………35参考文献……………36致谢…………………41个人简历……………42中文摘要宣目的腺病言毒(Ade挠novir安us,Ad爽V)是引起锯人类呼吸道识和消化道感淡染的重要病愿原之一，严摆重威胁着人衡类的健康。伶腺病毒导致毕小儿肺炎，却尤其是楼6煤个月至拉2相岁的婴幼儿贯腺病毒肺炎崖最为严重，绞感染主要是郑以乓3,5,杯7肉型为主,所恩以建立有效雄的防治腺病压毒感染措施高意义重大。宜六邻体是腺冠病毒主要的划结构蛋白，赠能够刺激机污体产生相应留的抗体，抑尼制病毒体构具象的改变，集从而中和病漫毒体。本实沾验组已经成卖功克隆并表污达了重组人惰3型腺病毒亡六邻体L1钉、L2亚基持，本次实验恩旨在纯化重房组六邻体亚魄基蛋白，检庄测其抗原性抖、特异性及摇体外保护情脑况。方法在宰原核表达系械统各E.col朋i量M15乞中高效表达脊重组人3型快腺病毒六邻疼体蛋白。利遮用Ni-N蛋TA琼脂糖碌亲和层析柱材进行蛋白纯袭化。用纯化淋的重组六邻竞体蛋白免疫紫新西兰家兔轧,利用免疫诱印迹技术检奉测其血清中巧抗体，鉴定侦该蛋白的免每疫原性和反捡应原性。利语用固定病毒协-稀释血清件方法进行中坚和实验，计甲算其中和抗插体效价。结栽果得到纯多化的重组人治3型腺病毒侍六邻体蛋白娘，该蛋白免膀疫动物后产饮生高效价抗滩体,达到1艰：1024贩000，该吼抗体能与人哄3型腺病毒符、含有该蛋括白的重组工性程菌株以及柔重组六邻体肤蛋白发生特眠异性的免疫谢印迹反应(顺Weste爽rnbl液ot剂)含，土不与E.c杰oli徐M15荐菌株、BS完A蛋白、柯却萨奇病毒和侄Hela细微胞等反应，绸证明该重组昆六邻体蛋白依具有良好的朵免疫原性和陕反应原性以值及3型腺病层毒特异性。根在中和实验毕中，该抗体牲可以有效地艇中和人３型缩腺病毒的感真染，中和效甘价为1:8铜00，结论锣所获得的木重组人3型渡腺病毒六邻昌体蛋白具有洗良好的抗原过性和特异性谢,耳其产生的抗撕体具有良好妻的保护作用愧，为开发研赢制高效、无器毒的腺病毒亭基因工程疫定苗奠定基础京。链[关键词纸]六邻体牲；纯化；免据疫保护；中胜和抗体价Purif犁icati从onan泪dstu足dyon栋the秒immun骂ology薄ofr狸ecomb息inant珍h摇exon酿ofhu沃mant露ype-3拿aden晶oviru宫s便Abstr勒act零Ob亡ject:助The版adeno姐virus渡one促ofth嫌emai按n粗patho均geny可whic殃hcau醉se奴respi约rator辩ytra再ct造and辜alime总ntary挣infe素ction泪and蛋cause角more具and抓more远serio漫us.疲Aden父oviru牙scan简caus复e她烂child裙pneu葵monia摩and坦them徐ajor吴infec旷tedt湾ypes络aret互ype3科,5a轨nd7赤etal尤，sot队oest塔ablis帆han率effec凯tive扯搁step赤to远preve喉ntion焦and洒cure萌藏Adeno为virus留infe侮ction按has吧asig录nific亿antm字eanin质g.He鲜xoni希sthe鹅majo落rstr衣uctur蹄epro咱tein传ofad贝enovi粒rus.脆It舱stimu鸟lates朗the贫body嫩topr茶oduce橡anti摸-body燕and奔inhib员itsc腾onstr六ucts木hift弓ofvi洋rust饺oneu浙trali各zeth踪evir涌usbo授dyit碍self.策weha扩veal努ready袖clon鸽edan世dexp衣resse团dthe扒刷recom淋binan及t世hexo企nof门human处type孤-3ad彼enovi袍rus.N盟owwe县inte淹ndto狐puri矛fyth挤e福recom斤binan窄t陆hexo兰nof自human供type席-3兆adeno湿virus净and片detec遣tits苗anti疮genic屡ity、哥speci翻ficit闲y众and是conse需rvati莫on冰exv瞒itro.冻托M友ethod拖s：Un冈dert益heop施timum顷exp客ressi户onco速nditi五ons,廊theh以exon晚prote摘inof咬huma糠ntyp惭e3a安denov六irus堂wase鬼ffici梳ently尽床expre兔ssed摔inE砍Coli燥.The稼expr狼essed掘prot手eins仿were鉴purif弟iedb动ymea伏ns桂ofN逗i-NTA丛荷affin湿ityc抄hroma什togra碑phy贪.Usi阵ngth恋epur研ified锤hexo扰nto赖immun蹦erab挎bita警ndte青stth挎ehex访on克’尼s政antig扫enici遥ty赌with正the晌metho拾dof慎Weste诱rn-bl撕ot睛techn箱ique忆.to父test尖竿neutr及aliza衰tion盼antib倍ody扎bym殿eans发offi魂xedv春irus-谋dilut疼edse钻rumw揉ay.Re湖sults未：The巨hexo语nof旁hum邪anty船pe3抬adeno芽virus能was枕purif与ieda坑ndwa恨spro热vedt痒oimm烤unet倘hera脑bbit仓with超high因antib须ody声titer揉(1:1谋02400获0)and絮the均antib车odyr兽eacte慢dspe革cific扫with生the帝purif峰iedr特ecomb陷inant预hexo军n,not伴reac优tedw至ithE梯.coli庙、BSA、葡Coxsa骨ckie箭virus本and牵Hela俩cell恭,the心reco漠mbina愿ntE.根co高list舌rain拢conta傲ining蔽the套hexon肺prot牌eina内ndth闹etyp露e3a厅denov恼irus赔itsel皮f.Th圣usit抚was穴prove祥dtha扔tthe仔蓬recom膊binan左t剂prot绳einp稀osses宗sedb绒otho默fthe骗high扫anti皮genic劝itya注ndhi斜ghsp殖ecifi鼠city识toty馒pe3芹adeno杏virus盈.InN拦Ates缘t,t矮hean鸽tibod锦ycan锤计neutr姻alize嫁aden专oviru日seff烘ectiv介elya蜂ndit让sneu匙trali抚zatio阁nant积ibody欠套titer领is1缘：墙800.身Concl接usion壤s肌：款The广recom萝binan兰t粗hexo福nhas锐high齐饥immun融ogeni杯city尤and铅reac栽tiono挽genic赠ity扎and拉speci印ficit偷y.It黎’消sant纱ibody健has苦remar醒kable研存prote匹ction戴.副扮This撇isve诸ryim巩porta咳ntto蠢prod巴ucee餐ficie至ntan党dnon功toxic国gene疫tice虫ngine熊ering无vacc斗ine蓬错again新stad稼enovi塞msin嫌fecti渡o躲n涛Keyw味ords恢：hex乐on,p遇rotei球npur姑ifica赌tion婚,i迈mmuno裳genic山ity仙,neut该raliz停ation丝anti填body文献综述啄腺病毒(A筑denov军irus,收AdV)是愈引起人类呼患吸道和消化愈道感染的重窄要病原之一娘，严重威胁热着人类的健院康自[1]贫。在<5岁属儿童的急性庭呼吸系统疾悠病中，腺病改毒引起的肺矩炎较为严重漠；在馋3岁以下儿镇童还易引起话急性肺炎，宫以3，5，禾7型为主垃[2]槐。象近些年在北塑方地区曾有亚过腺病毒的餐暴发流行，寨严重地威胁牵着儿童的健跪康和生命安建全，因此，投对腺病毒进耳行快速、特伴异性诊断和视预防具有重蔽大意义。腺倍病毒六邻体欢是腺病毒的野主要抗原，晓刺激机体产音生抗体，抑韵制病毒体构优象的改变，绍从而中和病坡毒体锻[3]遭。本文综述勉了近些年来葬腺病毒的国虽内外研究现稻状，对其致程病性、一般涛特征、免疫予学特性、疫辈苗及应用进坐行探讨。暗一.腺病毒功(Aden毛oviru蛋s,AdV矩)是引起人寒呼吸道和消慌化道感染的冈重要病原之萄一崇。饥腺病毒肺炎注是由腺病毒粱感染肺部引盆起的肺炎裙,酿是病毒性肺洋炎中最严重缠的一种。它高是由掀3惨型和省7侄型腺病毒所次引起的慰,修主要是由腺也病毒造成的客气管、支气疏管上皮广泛桂坏死挑,抄引起支气管婶管腔闭塞推,蓬致使病情加轻重得,党最终导致肺犬功能损害和雅其他功能障洋碍。不少危溉重患儿虽然之经过抢救挽只回了生命鱼,练但由于肺组竭织破坏较重首,登遗留不同程敞度的慢性肺农部疾病繁,选如支气管扩怀张症等宇,颤对儿童的健追康危害极大旱[听4颂]呀。进肠腺病毒例(ente退rica贞denov恰irus)撞是婴幼儿腹包泻的重要病苦原体。属于风普通腺病毒裁的份40,4交1盒血清型植,泽外形与普通笼腺病毒相同速,咽为直径层70钞～虫80nm虽的双链僻DNA腰病毒增,牵主要侵犯婴躁幼儿恒,颠通过人与人箩的接触传播购,固也可经粪丢—吨口途径及呼柜吸道传播枪[宵5坦]煤。本病无明骆显季节性级,笑夏秋季略多绑,插可呈暴发流边行。临床表叔现为较重的辜腹泻虏,息稀水样便帽,书每日刑3迁～肆30叼次。常有呼客吸道症状。唯如咽炎、鼻扶炎、咳嗽等要,玻发热及呕吐狭较轻附,趣可有不同程缺度的脱水征窃。病程言8烂～须12d匠。多数患儿内病后疮5涛～鸭7南个月内对蔗枕糖不耐受苏,专并可伴有吸陪收不良。喇二、腺病副毒的分类及愉其一般特征厌腺病毒在自织然界分布十稳分广泛，存故在于各种动梳物体内,伪分为感染惧鸟类忆(Avia闯denov井irus)吉和哺乳动物球(Mast梯adeno设virus素)慎的两个属。打后者从9种燥不同的宿主借中共分离到劣101种,竟其中研究最底广泛的是人铸腺病毒。目岭前,人类腺订病毒共发现植51种血清福型拿[6]何（以英文字阵母和数字表加示）,可分耳为A～F六监个亚属。它办们在组织趋况向性等方面勒都有着不同婶的特性貌[7]伙。A～E各锅组型病毒能坝在人的组织键细胞（肾细轿胞）常规培肥养中增殖,妨称为普通兼腺病毒,F兴组的40、但41型病毒伤是从粪便中眠发现用常规船细胞培养不表能增殖的腺浮病毒,称为挥肠道腺病毒啊。有些腺病泥毒在动物体托内可致瘤，掏在体外能转爸化细胞蓬[8]薯。熟腺漂病毒无包膜葬，注20面体对妹称，直径为招70～90筹nm，有2荒52壳粒，脖其中20面俊顶角壳粒为雁12个五邻忍体（pen免ton夏，82事KD），每锅个五邻体有管2条纤维，氏长度相同或型不同纤维上剖带有主要的跳种特异性抗套原决定簇和阵次要的亚属蹄特异性抗原施决定簇。除院五邻体外有锻240个非慧顶角壳粒，猛称为六邻体宜（Hexo住n,120做KD），后竖者带有主要且的属和亚属锄特异性抗原块决定簇和次券要的种特异青性抗原决定味簇叫[尊9夺]窑（图一）。买炼编图一、腺病冠毒的结构原Fig1泄.Str旺uctur派eof卧adeno类virus坐腺病毒的形列态是特征性龄的二十面体满病毒壳体（瞎Stewa乌rtet花al.,陷1993乐）。其病毒慰壳体含有三劫种主要的蛋侄白：六邻体陕（II），不五邻体基底通（III）耗和纤突（I岩V），还有丸多种其他的折辅助蛋白V玉I，VII物I，IX，久IIIa和绞Iva2（趋Fig.阴1）。腺病评毒基因组是尤一个线性的涂双链DNA蛮，其5’端曾与一种末端右蛋白（TP呀）共价结合白，5’端上灾还具有末端抵反向重复序肢列（ITR兰s）。病毒敬DNA与核震心蛋白VI腐I和一个称坛为mu的小律肽紧密结合臂。另一种蛋拐白V包被在积DNA-蛋悟白复合物上达，并且通过狠蛋白VI为出DNA-蛋阁白复合物和馒病毒壳体间产提供了结构乏上的联系纱[10]古。病毒含有夏一种病毒自阀身编码的蛋醒白酶，这种绣蛋白酶对于静加工某些结鞠构蛋白从而型产生成熟的亦具有感染性四的病毒是必快需的愉[11]比。绞腺病毒恼家族（Ad逼enovi失ridae良）的成员可讽感染种类相皂当广泛的有使丝分裂后细挂胞，甚至包晌括来自高度另分化的组织断中的细胞，跳例如骨骼肌红细胞，肺细义胞，脑细胞仔和心脏细胞万。因为腺病酷毒可将自身帜的基因组递叼送到细胞核巩中，并且高摇效率地复制想，所以腺病旨毒成为表达安和传递治疗厉基因的主要曲候选者阶[12，1档3]嫩。喂三、六邻体抓蛋白的结构散和功能军目前,已对蚀六邻体蛋白势（图二）进俩行了广泛的闷结构和功能蚕的研究绒[14]右。每个六邻嗽体是六邻体狗蛋白的同源丘三聚体，是岂大于900理个残基的复姨杂蛋白大[15]爱。三聚体的氏六邻体分子封有一个五面格体的基底和诚三角形的塔逃尖，基底包吴含两个区域惧P1、P2卸区，经过对茂Ad2电子栏显微镜观察乒和x线衍射病分析，P1诉、P2在内恼部卷曲成8喘个稳定的鞋β闪折叠反向平虎行结构,塔争区由三个环妨构成L锋oop聚1、L彻oop咱2、和L摄oop4尊。通过用一帐组单克隆抗奶体来检测不劲同型的纯化土的六邻体蛋穴白表明，在熄六邻体表面拳有许多的抗限原决定簇存盾在在这几个爱环上。对规Loop左1、富Loop2制、御Loop4压进行了研究沸，其中退Loop2氏、泼Loop4誉卷曲成团，争和三聚体中待的其它两个府多肽链的相先应区域相互棚作用,环间牲相互指状突烟起使得三聚为体的结构相险当稳定正[滚16拜]轰。氧Loop1起是最长、最倍复杂的环，剪自身折叠许亿多倍，向外驰突起最大限欠度的与周围好环境相互作移用。对15妖个不同型的态腺病毒的六利邻体蛋白的列核酸序列研被究表明基底踢的P1、P禁2区是保守殃的，变化区苗主要集中在贪L雨oop庆1、L楚oop堆2区魄[17]渐。边Loop尖1、检Loop爱2的所对应抢的氨基酸是遮1419容—披1428个邀氨基酸，其止中有250散个变化的残攀基，存在有跟七个独特的锡超变区（H终VR），在密这七个HV电RS中，H手VR1~H池VR6出现抱在L煌oop滤1中，HV恋R7在L欧oop2掩的塔尖。这搜些HVRS露在不同的血耗清型之间的集长度有所不垃同，变化范部围在2~3顷8个氨基酸透之间。其中俱HVR1、遥HVR2、疾HVR4、赔HVR5、忘HVR7中寄含有中和抗香原决定簇的谊一部分丢[18]见，而且抗原迟决定簇的至张少包括两个客或两个以上励的HVRS苹。在这五个撤HVRS中延包括大于9侵9%的六邻叙体型特异性巨残基。在L窃oop凯1、丈Loop棒2当中，这俭些保守性残璃基形成HV薯R区的框架陕，代表着临范近区域的不咱连续链的相之互作用，2林/3的保守且序列是疏水恒性的更说明圣它们承担的拒是结构功能舍。在HVR聚S区中，H桥VR1、H窃VR6是L扮oop1碗内部支持区住，而且HV塞R1是残基宗变化最多的屡区域。HV破R4、HV清R5是L陕oop1塑的主要外部层支持区，H枕VR5位于衡塔尖，塔区限的重量变化年主要由这两庸个区域来决半定。目前，马这五个HV做RS区相应碎的氨基酸序识列以及所对崖应的核苷酸恒序列已经确宜定。由于这察五个HVR符S位于L吃oop1夺、糖Loop2弹,所以L属oop1栏、窗Loop2咬是较好的中查和抗原决定梯簇务[19]礼。知图二、六邻慰体蛋白的结钩构葱Fig2千.Stru过cture德ofh猴exon顺六邻体是病央毒的主要抗秧原蛋白,含扮有大量的抗按原表位,如飞型、型间及乌组特异性抗两原表位及中向和性表位。渴但大部分抗色原表位在蛋唇白的一级结归构上还没有扭被确切定位借[20]泳。不同型别蒙的六邻体有樱很高的保守屑(78%～俯95%)张[21]衣，型间与组酬特异性抗原装表位定位于塑这些保守的贯区域，可能势具有一定的久抗原性，可岸作为病毒感焦染性疾病诊剧断的靶抗原拳位点。映在六邻体的眯前段和中段径,有大量的辱抗原性高峰盼及较密的亲疼水性高峰区强域。该区域妖含有大量的掉保守区，可辜能具有较强批的抗原性及球很好的暴露螺性，并期望妨能够作为型嘱间特异性表场位，诱导高浩效价的抗H慌AdV特异览性抗体。六守邻体的后段膜主要由环4辟、P2区组轰成，尽管该宝区域在病毒逃颗粒上亦有习较好的抗原傲暴露性，并赶且序列的同坏源性较高，光但疏水性氨狸基酸残基较栋多。抗原性谅预测分析显扫示，六邻体惜后段的抗原截性高峰较稀匹少，相反，肚疏水性高峰蚁多而密，提止示该区域的斯总体抗原性壤较弱。偿四、腺病毒裳血清型的确瞒定竟腺病毒血清厅型的确定是始根据感染性酷中和反应，野它是型特异透性，直接针简对六邻体蛋影白的中和抗触原决定簇。愉血清型又根闻据核苷酸的疤同源性、纤挂维蛋白的特勤性以及生物侦学特性来区瑞分为六个亚溪型（A、B何、C、D、谋E、F）另御据研究发现聚，在这几个盒中和抗原决浑定簇所在的糕几个超变区辣HVR绩1红、HVR2恩、HVR4肆、HVR5似、HVR7蜻当中，发生牢了广泛的染茧色体的非正讲常重组袄[22]吵，包括短的叠直接重复序歼列的缺失、菠插入、重叠饮。而且A陵dv螺血清型的进脾化是由于在位HVRS中蜜发生非正常同的重组（抗裹原行迁移）聪，并伴随有搏单一碱基的杂突变。，而桑且六邻体蛋旦白的血清特停异型也位于懒L可oop忘1、Loo饭p2的七个松HVR休S放中。在HV腥R绒S熊的重组又形笛成独特的新立的血清型，面这种独特的被血清型由组秆成中和抗原锄决定簇的残芹基的数目、无位置、生物挨学特性所决述定。此处需昨要指出的是帽血清型的鉴藏定不局限于口中和反应，筐有研究者利拣用限制性酶仔切分析，鉴延定特异性区用域(SSR华)来确定血量清型，而且锤所需的时间扎比中和反应敢所需的时间丝少的多，前骄者只需一周虎，后者要三昨周，最后二疑者的结果完堡全相同。也比有人利用六惨邻体蛋白的畏一个结构部融分pIX进尊行亚型的鉴轧定，pIX伸是14.3还KDa六邻仪体很小的组斤成蛋白，它已位于每个六毅邻体壳粒的绑中间，C末头端序列暴露界在壳粒表面主，N末端伸狼向壳粒内部桨，pIX的惊作用是作为坐一个粘性因器子连接六邻组体剖—冈六邻体，而榴且它在DN祝A包装的过庄程中也起到鸽重要作用。殿pIX的核咸甘酸序列在缘不同的亚型助间表现出明燥显的差别。列有研究小组挡设计特异的震引物，应用塞聚合酶链反值应(PCR凉)，可以是统全部的pI校X基因以亚扒型特异的方础式进行扩增商，说明利用收pIX进行崇PCR分析姓，有助于腺戏病毒亚型的咽鉴定扎[23,2井4]欢。洁另据研究发周现，在这几闪个中和抗原拉决定簇所在怀的几个超变止区HVR1蹈、HVR2狮、HVR4除、HVR5已、HVR7斗当中,发生栗了广泛的染敏色体的非正粮常重组，包删括短的直接只重复序列的博缺失、插入馒、重叠。而寄且Ad血清据型的进化是歇由于在HV心Rs中发生杰了染色体非经正常的重组音(抗原性迁摸移)，并伴石随有单一碱鸟基的突变。彩HVRs的黎重组又形成扰了独特的新创的血清型，混这种独特的吩血清型由组抽成中和抗原狡决定簇的残传基的数目、驾位置、生物洁学特性所决错定。希五、六邻体奴的免疫学反圾应箩为了研究腺找病毒衣壳的铲三个主要成位分所引起的厚免疫反应，踏将复制缺陷茅型腺病毒（铸Rec-A谦d监）注射到B找ALB/C伞小鼠体内进遗行研究。实厉验结果表明火，采用不同狡的免疫方式茅，产生的免倒疫反应有所延不同。通过诞iv喊途径进行免际疫，产生洁anti-愚Fi(而抗纤维)、各anti-摊Pb(苍抗五邻体)绩、范anti-宵Hx(缎抗六邻体)沸的抗体；通随过兰ip荒途径进行免赞疫，则可以竞产生冒anti-郑Hx强抗体。由此脑表明腺病毒演有三个结构慈性抗原竖[25]裕，抗体可以描与其结合，煤发生感染性先失活：这些辽抗原分别是刚纤维、五邻踢体、六邻体夏。A讨nti-F刚i尤抗体的作用扇主要是聚集勒病毒体；群Anti-漂pb昂抗体的中和衣作用是阻断春酸性细胞进椒入细胞浆；复A推nti-H亡x品抗体，既可劈以通过聚集麦病毒体起中躬和作用又可罚以在低PH逝值（惕PH5.0送-PH6.聪0英）下部分抑异制病毒体的绞构象改变，仁从而中和病辽毒体抄[26]泊。病毒的六异邻体包膜在对最初的感染伟阶段起着很洞大的作用，弦在PH值降励低的情况下右，六邻体蛋害白发生构象晓的改变，暴芝露出分子的勿N-端。P肉H值诱导的供六邻体构象莫的改变，对龟于以后五邻乎体基底的暴止露，或是参键与病毒体脱敞去包膜是很加必要的骆[27]驱。搬1983年盯，有研究人陕员认为六邻湿体蛋白为型席特异性抗原制决定簇，是桌中和抗原的略靶点，是病食毒体对免疫片选择压力最舞敏感的部分些。它的特异傍型很可能氨补基酸的靶序剪列决定梅[28]饲。浇为了研究不腊同腺病毒六虚邻体的抗原参决定簇的组伸成，应用6氏1个小鼠腹珍水（包含M愤a喷b毕），分为三比组进行。其夜中不同的抗若原决定簇的材分布和标志它由Ma南b奏进行识别。塑在研究抗原筒决定簇组成男的过程中，题反应型和所钻有的61个笨M叠ab燕的滴度间接进由ELIS杠A来确定笋[29]研。由M穷ab比识别的抗原朽决定簇是六延邻体型特异弯性抗原决定拘簇。用M衬ab盒来区分21炎个不同的六依邻体，这6拢1个Ma任b龄用交叉反应崖类型和滴度滥的相关系数痰进行处理，影由此识别出钥25个抗原玉决定簇类型席，而且型特步异性表位只蝴存在于同源匹六邻体的表净面耍[30]驱。宫有研究表明铁，城a狡nti-H织x咸抗体有着极落强的中和反祖应，而且阁anti-弊Fi菊和瞎anti-今pb沸抗体在丹anti-闸Hx叫抗体所获得预的中和反应博上有着协同漠效应，而且冠在由蜜iv份中可以引起轧最强的中和腾反应活性。巡A室nti-F增i问抗体虽然存交在，但是它舱们不能有效俩的阻断病毒腹感染，所以句说纤维蛋白琴不是一个很米强的中和抗仪原决定簇，纺只具有很弱邻的免疫原性潮。腺病毒的蚂中和抗原决俊定簇主要在境于六邻体上模，在当六邻汁体被替代或灯突变将会导藏致中和免疫擦反应的缺失应。因为六邻曾体作为腺病乡毒的主要结葛构蛋白，参袜与各种各样籍的复杂蛋白肚的相互作用妖[31]敞。所有研究者应搅用比色法进甲行中和反应合的分析。用准于定量测定浪A晨dv赔抗体的血清精学滴度；在风血清学的流肾行病研究中而筛选型特异萌性中和抗体芽。尤其当抗套体的水平低奸于50-8获0%时，用嘱比色法来确薯定低水平感谋染更为有效犬。使用这种灾方法来大规敬模地筛选血括清和Ma茂b烧，以获得存富在血清标本年中的中和抗企体值写[32]负。娃六、疫苗的桨研究逗八十年代，捎在军队中广好泛应用A饱d7境作为减毒活万疫苗，来预帖防呼吸道疾华病和眼疾病么[33]关。有人研究某过应用六邻购体亚单位通创过阴离子交巩换层析纯化宇，以获得纯哑化的牛型腺惧病毒灶Ⅲ寒型的六邻体佣免疫奸—根刺激复合体孩进行免疫，舟它可以在兔读和牛体内诱窄导产生中和余抗体。由此糊表明BAV偶-3六邻体惨可以制备成旷多价亚单位差疫苗，保护鸭牛抵抗多种紫呼吸道疾病季[34]育。刺目前国际上呼主要集中研吉制腺病毒的胖基因工程疫牌苗。病毒的丙复制及病毒客基因表达的访减少，对于篇开发活疫苗叶和用做基因摧疗法的载体芽是所必要的塑。例如，细或胞毒性基因帽的失活，对队于产生减毒稍活疫苗是很陆有意义的搜[35]宰。在转导细沸胞内减少病魔毒基因的表糖达，可以导熟致病毒载体免安全性增加惭。在腺病毒佣体内，病毒罢基因的复制盈和病毒基因率的表达可以允通过转换控灭制因素，启更动子的替换倦来减少。曾足有人通过坛E4目启动子的转稠换，使启动印子功能减少瘦，减少病毒储后期基因的潮表达。在欠H1229汇细胞内，通浓过轨E4条启动子的替椒换而构建的肤载体，所诱怪导表达的纤演维，与野生燃型相比，大去大减少党[36]确。采随着分子生葬物学技术的即开展，对腺里病毒的基因烫工程疫苗的俯研究也开展属了起来。国绵际上，有人膏应用A字d2允的帜loop1欺区的抗原决辩定簇在B组伙苛萨奇病毒川中的表达。鸽以苛萨奇病嫌毒作为载体油，重组腺病乡毒六邻体蛋布白的L1环辉，以使其在华H伟eL柔a细胞内稳匀定地表达，巩所表达的蛋捎白，可以诱碎导产生既抗差腺病毒又抗施苛萨奇病毒辜的中和抗体蒜，进而研制妇多价的基因需工程疫苗警[37,3岭8]舟。天七、病毒感戏染的特异性牺免疫例（一）体液集免疫作用腊病毒的抗体烧可自感染者些血清中检出付，因此较早肤被发现并进傍行了较深入厘的研究。病泻毒感染后最贫先出现的是塘IgM类特玩异抗体，一变般在感染后侵2～3脚d头血清中开始础出现范[39]您。以后则出秋现IgG类弦抗体，并随慢不同病毒种粪类而持续时果间长短不等赵。一般经粘经膜感染并在飘粘膜上皮细饥胞中复制的贯病毒在局部云可诱生Ig静A类抗体。股特异性抗体衰可用于诊断截。在体内，踩中和抗体的或抗病毒作用忠至为重要。叨1倾、智中和抗体妻俯脏这种抗体能蚁与病毒结合处后消除病毒驼的感染能力乱，故在杀灭谱细胞外的游航离病毒中起送主要作用。寨其作用机制否是改变病毒崖表面构型，跟或与吸附于立易感细胞受歪体的病毒表昆位结合，阻证止病毒吸附敢并侵入易感师细胞和增殖河。病毒与中欧和抗体形成捞的免疫复合扶物更容易被变巨噬细胞所载吞噬、清除啊或改变抗原史递呈途径。司有包膜的病冻毒表面抗原颜与中和抗体型结合后，激境活补体，可狠致病毒裂解肌。IgG、温IgM、I懒gA三种不联同类型免疫掉球蛋白的中凤和抗体具有分不同的生物堪学特性。由绕于IgG分榜子量小，通口过胎盘，新野生儿可具有们来自母体的奋中和抗体而蚕得到约6个冶月的被动免薄疫保护期。秘IgM因分差子量大，不洁能通过胎盘者。如在新生度儿血中测得南被动特异性秧IgM抗体乱，可诊断为棒宫内感染。罚病毒感染后张最早出现I跃gM抗体，污故检查Ig挡M抗体可作播早期诊断。骡IgA抗体喘主要来源于护粘膜固有层谁的浆细胞，渠存在于粘膜披分泌液中，缝在局部免疫这中起主要作陵用，常可阻象止病毒的局楼部粘膜入侵无。痛2合、涛非中和抗体挠有些抗顺体是针对有陪包膜病毒的喝基质或其中证的核蛋白，减有些抗体是姿针对病毒表该面具有细胞服融合功能的补酶或病毒复福制酶等。因固这类抗原与址病毒入侵易斩感细胞不相喇关，故相应纹抗体无中和姿作用，但有断时具有诊断咬价值。病毒杂抗体的诊断梢方法随不同兼病毒而异。夹3非、桂抗体介导对泼靶细胞的作庄用因有光包膜的病毒算感染细胞后安，细胞膜可灰出现病毒编倾码的蛋白，忧能与相应抗宵体结合，在料补体参与下谊裂解细胞；差也可通过抗虑体依赖性细霸胞介导的细撞胞毒作用（莲ADCC）慕裂解与破坏尝病毒感染的伞细胞。珠4僵、沙抗体介导促债进作用（e垮nhanc申ement荷）抗体配与某些病毒趟结合后，可队促进病毒在览感染细胞中塘的复制，如骑登革病毒、比呼吸道合胞界病毒等。对格抗体增强作歼用的机制还身不明确。实尚验发现Ig梁G抗体有促造进作用，而休IgM抗体边则无此作用杆，推测可能婶当抗体与病兽毒结合后，舱更多的病毒舍进入巨噬细骑胞而增殖，走在细胞表面闹出现的病毒赤抗原激发了底机体的免疫勿应答。其中起，巨噬细胞流释放多种酶寸（如蛋白激爪酶、凝血酶寿等），进一栗步激活补体凳和凝血系统千，释放血管六通透因子而傻引起一系列记病理变化而丑发生严重疾唱病。炮（二）胞免至疫作用事对细胞淡内的病毒，举机体主要通沟过CTL及恰T细胞释放庄的淋巴因子衫发挥抗病毒铺作用。细胞嫩免疫主要在束病毒感染的导局部发挥作剂用，其作用韵方式为通过搅免疫细胞接蜂触靶细胞后灵杀伤靶细胞糊或在局部释急放细胞因子懂，因此检测艇细胞免疫的阵技术较体液联免疫为复杂管。购1占、苗杀伤性T细铺胞（CTL票）CT宝L的杀伤性辨作用具有病折毒特异性，忆一般出现于迁病毒感染后激7d左右。秋当CTL活王性开始表现冤则NK细胞浴活性逐步降绸低。CTL药接触病毒感短染的细胞后篮，特异地识管别与MHC际分子结合靶射细胞表面的瘦病毒抗原特迁异肽段。在扇识别中还有额一些附加因兆子如CD3烧、CD2和貌一些粘附分奏子等。CT衣L接触靶细糟胞后被激活填并释放穿孔支素及细胞毒棕素，穿孔素碗是一组酶的程统称，其作贷用类似补体屡的C贫9农，致靶细胞乌出现许多小汪孔。细胞毒础素可激活靶怠细胞内的一掌些酶、细胞迹，或自身裂胞解，或发生绿凋亡。在多仇数病毒感染钟中，因CT降L可以杀伤抢靶细胞达到竖清除或释放原在细胞内复刚制的病毒体慧，从而在抗劣体的配合下张消除病毒。客因此被认为蜓是使病毒感危染恢复的主妥要机制。千2犁、战辅助性T（狗Th）细胞修Th莫细胞可以促贩进B细胞生是长与分化，其并活化CT恨L及巨噬烟细胞。由于炊在小鼠中发绝现有分泌不渗同淋巴因子纲的T细胞类竟型，对可分私泌IL－2摊和IFN－脾的T细胞称蓄为Th1类龟型，对分泌宿IL－4，冤IL－5和崇IL－10径的T细胞称艺为Th2类巾型。在人类固亦有类似的万分类，但不矛如鼠中明确批。在病毒感仓染中已发现仇当患者的T见h细胞有上油述类型的转彻换时，病程情可以变化，案但其机制及涌意义还有待卷于对细胞因朴子在免疫网垦络中的作用丧进一步分析发后方可阐明召。Th细胞凤功能低下则吨可影响机体严的抗体产生借及CTL的素作用。隐3柄、鞠细胞因子救在实验动士物及病毒感匆染者研究中那发现，个别添病毒感染后丛虽CTL有困抗病毒作用馆，但并未发卧生靶细胞死迷亡的现象。凤这一现象在壮神经系统病千毒感染，以警及乙型肝炎举病毒持续感册染中已被证氧实，其机制渔是由于释放题IFN－助等细胞因子繁所致。有人迷称这一现象妹为非溶细胞攀性T细胞的洗作用，即通厨过CD陶4净＋疾T细胞在感冒染病灶的聚悦集，受特异瞎的病毒抗原丸所激活，分河泌大量抗病蛛毒因子（I耻FN、TN妥F）。这些亩细胞因子又样可进一步激垫活T细胞（券CTL，T剧h细胞）坊、坊巨噬细胞或兵甚至NK细骄胞，在抑制串病毒复制及槐清除靶细胞闷内的病毒协绵同发挥作用宾。拳腺病毒六邻凑体蛋白的L硬oop1、屿Loop2祝是较好的中赔和抗原决定浮簇，本实验融组已经对这隶段基因的进剂行了克隆、导表达并优化惑表达条件，才现将其大量善表达，纯化孟重组蛋白，慈并进一步进枕行活性鉴定反，用作抗原莲动物免疫，回并检测其所嫌产生的抗体百。通过中和在实验检测其誉体外保护情渡况。应用该净方法进行疫锄苗的研制，毛将是一种安肌全、可靠、课行之有效的窜方法。因此怎本实验组针伏对Loop堆1、Loo梦p2区(六暑邻体抗原决身定簇所在区不)的基因工威程疫苗的研宅制，将可能筹成为未来高扩效疫苗研制池的一个重要斩手段。付前仓言暗腺病毒卵(Aden皱oviru陶s)昂是班DNA答病毒率,竭可引起多种庸疾病傻,莫如呼吸道感脸染、流行性这角膜结膜炎查、腹泻等。鸡目前已知的符人腺病毒有牧41朝个血清型帖,建其中某些型威别无论是在过成人中还是寻在儿童中可愿引起急性呼谜吸道感染的乖现象已经备充受关注卧[向40、41定]漫,研其中人薪3筐型腺病毒尖(Ad3)赞是引起急性予呼吸道疾病蓝和咽膜热的钢常见病原体闹,对严重者可引接起支气管肺肆炎。200土3年受“阶非典围”拴在我国部分补地区流行以使来，给我国捧人民生命健酬康和国民经刮济带来了极制大的危害，据也给人类上宜了严肃的一特课。因而，康开展对远比折冠状病毒种方类多、宿主坝范围广、感携染途径多、倍致病性强、根病死率高、腥危害严重的僵腺病毒的预舞防性研究具类有重大的社滚会意义和经哭济意义。奇预防传染性矩疾病的最好啄方法就是疫手苗，目前，梦3、4、7把型腺病毒口假服减毒活疫短苗经国外小厚规模应用已赵证明有预防路效果，但尚住未大规模生瞒产和应用麦，国内还没伴有相关报道管。基因工程嫌疫苗正在研店制过程中。蓝六邻体是腺散病毒感染的爪主要抗原蛋唱白，其中门Loop1且、矛Loop2灿区是较好的炕中和抗原决尽定簇，能够贤刺激机体产脉生相应的抗头体，抑制病搏毒体构象的标改变，从而支中和病毒体核，本实验通摇过免疫家兔骄，观察其状吨态变化，检剂测其血清中幅抗体的产生制及特异性，蚊并通过体外苏实验验证了域其具有保护丹作用，为今锤后研制高效呆、无毒的腺洒病毒基因工教程疫苗奠定冤了基础。实验材料德一抬、碗菌株及病毒龙1粮、虏工程菌大肠篮杆菌M15框pQE31跳Hexon艺本课题组构回建码［42］栗。渡2肢、搏Hela真细胞、人腺调病毒3型病疼毒、感M15菌株吵由哈医大微折生物学教研介室保存。朽二拜、现主要试剂盒骡1翅、怠SDS-P姿AGE中分课子量标准蛋薪白质购自中款科院上海生墨化所。线2照、吴Ni-ag希arose毙层析柱购自榨QIAGE炮N公司。粪3滤、连DAB显色取试剂、羊抗即兔于IgG浇抗体购自中帝山生物制品邀。烦4种、骂预染Mar与k那er佩购自中山生术物制品有限吃公司。伸三许、抄主要试剂及鸟配制方法妨（一）SD最S-柄PAGE慕电泳所需试塞剂安青1陆、概跳12%SD则S-PAG敞E庙分离胶党涉层饼10.0臣ml播屈ddH月2滴O店妄革疫此感偶3.3跌ml东钳30%丙烯右酰胺溶液伞掀太4.0杀ml仍桂1.5娘mol/L退Tri庆s-cl(晓pH8.8鸽)奸翻2.5m纪l是宜10%SD缠S茄安0.借08机ml撇积10%口过硫酸铵享绸0.08京ml议乖TEMED线眼照0.008殃军ml燕2躺、彻5%SD蹲S-PAG晒E积层胶阵记芹每帽糕3.0ml何秩ddH李2细O鹅虏晒2.1揉ml原世30%丙烯扰酰胺溶液纲联坏0.5牺ml忠拦1.0劝mol/哑LTri妨s-cl(丝pH眨6.8鸽)估乞0.38田ml屈10%SD遗S朴界集崇扭0.03篇ml站冈10%金过硫酸铵柔义0.03材ml种级TEMED煎蛋肌0.003仪ml边3亭、休30%丙烯介酰胺溶液敞误丙烯酰昏肠左哪完地背30.0摄g怎宣章唇壳拿亚甲双丙烯养酰胺耻愤确狭烤0.8廊g花虑离子水（晚ddH铸2武O港）摊恐诵撑100.金0田ml捏4纯、索10%过硫粒酸铵盈1华g艘过硫酸铵溶徐解于10辅ml委的水中，于篇4慈℃坐贮存。室温微、绿避光保存。僻5翅、滴2拖X秃SDS凝胶壁加样缓冲液警4素X鞋Tris堆-HC牵l/SDS弹,Ph6.涝8(0.1驼mol/L诱)磁福2记5柏ml急学桐甘油拥[20捧%（崇W/V作）]猪私著石赤妈20ml以谣被SDS防[4%（机W/V芹）]位千趋哪4丑g缎尾长棋溴酚兰[便0.00合1%（盲W/V娱）飞]福纪围1温mg刺幅加有ddH在2析O真至100参ml淡并混匀，等财量分装成1杨ml直于-70听℃男贮存。既6土、馒5搭陆X蜜蔑Tris-澡甘氨酸电泳爽缓冲液哪Tris碱届顷15.1芦g迹两G刃lycin扒e赔（吨pH8.灯3烘）窄锄94.0斗g逃挡SDS(雪电泳极戒)胜兄博爸嘴5历.0娱g滚刃加看ddH敬2泰O单至1000印ml毫，使用时1兰：5稀释，蜡室温贮存。岂7瘦、趋0．25%漏考马斯亮兰防R惧250碧染液仗取考马斯亮暮兰结R辞250说1.25仆g衔，溶解在5轨00偏ml面甲醇：水：杏冰乙酸=4诵5：45：悲10（体积岛比）的溶液余中，用郊whatm渔an堵1鹿号滤纸过滤其，于室温保简存。总8沟、歼高浓度脱色谣液士甲挺醇：水：冰期乙酸=45床：45：1款0（体积比笋）混匀于室扮温贮存。啄佳9拥、畅低浓度脱色岂液池绵甲醇：水：诉冰乙酸=木3祖：子1牺：循6牵（体积比）眼混匀于室温庄贮存。馋仙10仇、劝8．1刃mol/进L订DTT（涛二硫苏糖醇蛇）革用20摆ml啦0.01偏mol/L茎乙酸钠溶齿液（傲pH凯5.2）溶玩解3.09杠g穴子DTT爆，过滤除菌泉后分装成1葵ml前小份贮存则于-20按℃极（二）纯妥化试剂挨1填、弊Buffe俊rB(剪裂解液护)补磷酸二氢钠在赏朋13.地8振g蜘Tris烟碱陪伸序1.2这g崇尿素环嘉顾猴480.5德g烦加悬ddH碌2短O赏至1000捕ml,尚用N软aOH膜调侨pH游至撑8.0豪。型2做、腾陕Buffe蜘rC(鼻洗液贿)龙磷酸二氢钠节染世13.8决g纷Tris疼碱挺峡疑户1.2乏g那尿素剪辟辫悲480.5妹g爆加斤ddH五2姥O怖至1000是ml,鬼用N耕aOH垮调毛pH导至6.3。槐3剃、跳访Buffe堂rE放（洗脱液什）穷磷酸二氢钠锤迟搭13.8波g塘Tris况碱盈众叔只1.2居g籍尿素理检杜妄井480.5值g费加纠ddH歉2斤O挑至1000竭ml,么用N井aOH疫调涨pH刊至顽4.5值。玩（三酱）默Weste复rn-bl扬ot所需试佣剂企1饮、摇电转液张则蚂也渔1L境蛾Gly饶cine口会蓝嘴2.陕9g疲钢Tri这s碱蒙葵讯转5.8社g驰类SDS适顿脖垮极0.3努7g续宝甲醇死糖辣斧杰200ml黎用d核dH肆2呆0定容至蜓1L弱2恩、膊封闭液（5跳%脱脂奶粉校）耐茫脱脂奶奶粉碎吊善斩5g瘦捐PB诵S定甘属富1炸00ml善3浩、挥1%BSA样BSA罩期煤莲舰1g艰PBS方前械川浑100m驱l述4爬、宰PBS(邮0.02M斗PH滋7.4)陈1L菊Na起Cl诊草点膜劫8g元阻K乏Cl膏贸涉况检0念.2g厨Na工2揪HPO拾4捡.12H绑2骄O聪捆斯3.6g梅KH哭2环PO去4龟幸种莫斑0.24怪g化dd猫H窜2蜘O廉纲虹挤80尼0ml露定容至10采00ml寺调PH至7之.4陪(四)应等细胞培养液落1储、梨生长液：黑1X164鼻0乔培养液勉甚票峡涛88%用择境胎铅牛血清拾倒拾金橡1羽0%比袍螺双猜抗（P、S甜）廊浆袖疼1%活用5.6%听NaHC盈O涉3扯溶液调pH趁至7.2-替7.4躁2泽、抚维飘持液：家DMEM液葡疼刑熟先潜96%吐网灭恭胎牛血清樱滤兔滴鬼赶2%即繁午仿双抗（P、扩S）裤威懂搜模1%苹用5.6%信NaHC净O选3央溶液调pH那至7.2～腔7.4盛(五)SB峡培养基及其耳所需试剂印SB培养将基血胰化蛋白胨诚甘20端g住酵母提取物碗侦10斥g周氯化钠册咱10右g企加去离子水殖牙950ml验并搅拌使之爪完全溶解，滥用5滋mol/L御的N脂aOH荒调pH值至翅7.0，定茫容至1L，倡高压蒸汽灭盲菌蹦(15挖磅，1.0诚34佩×游10思5递号Pa幅)20～3匹0扬min济，4挺℃项保存。水芽（六）其彩它常用溶液引1嘱、标1梢mol/L匆HC雨l干按以下顺序喷混合化913.8杏ml标指驻H慈2药O竞战86.2金ml拳深浓盐酸突2恩、贡10绩mol/L羞N触aOH倡库将400秋g帐N锹aOH境溶于450门ml魔水中，补加拼水到1L，选高压灭菌。姻3而、茶0.5腔mol/事L少EDTA鞭（乙二胺四衔乙酸）竭称取186茶g荐EDTA贿溶于800由ml雪去离子水中泊，加入N肤aOH裹调工pH祥8.0，补所加水至1L侨，高压灭菌导。饼4昆、来50%甘油欢50疤ml疤甘油，加水辞至100柄ml姥，高压灭菌陈。浴5云、绵10%S率DS料在900窗扰ml峰水中溶解1秧00弯g缸SDS，照加热助溶，护加入浓盐酸富调节溶液的艳pH代值至7.2蛋，加水定容杀至1L，分傍装备用。亚顷煤6疫、馋IPTG绣（异丙基硫惯代-硬β装-D半乳糖爪苷）放在8和ml岩蒸馏水中溶菜解2挂g皂IPTG后捆，用蒸馏水以定容至10猛ml嫌，用滤膜过来滤除菌，分魄装成1庆ml携小份，-2娘0恳℃绣贮存。驱7床、裙1毛mol/L筒效T有ris微在800视ml叶水中溶解肝121.君1局g谅粱Tris豆碱，加入浓歉盐酸调节梢pH贺值至所需值验。虏衫砍虎进PH壶疼扁锦铃吩撑介藏HCl饰渴幕悬7.4污扁70ml狐童7.6恳陆极倦冲知60ml黎艰艳菊禾性8.0咽熊敌合膛免42ml屋应使溶液冷集至室温方可是最后调节卖pH斩值，加水定主容至1L，冤分装后高压痒灭菌。围8泥、逐乙二胺四乙发酸钠（ED扫TA）垂用去离子水先溶解EDT为A，浓度为熔0.02%撑，高压灭菌银，分装小瓶刷，于4智o施C支冰箱保存。此9秋、栋青/链霉素滴储存液（1漆0000U姿/mL青霉粘素和10m长g/mL链敌霉素）障称取121秒mg(16值50U/m磨g)的青霉诸素和200唉mg链霉素蝴，溶于20榨mL去离子钓水中，经0蛋.22例µ传m的滤膜返滤过除菌，况分装并储存搏于－20道o腰C删避光保存。轧使用时以副1悔:暖100参倍稀释。纯四缸、改主要仪器设莲备茧Herae倍usBi课ofuge造17RS罩槽型低温高速哭离心机鲁HITA知CHI供低温高速离糕心机只TLT-1圣3V-85禽V14回型超低温冰痒箱抚Minsk催16E欺冰箱林WS2磨-261-唤79HW侄1弃型恒温水浴还箱毅HH.B1熄1-500阁饺型恒温培养紫箱德ML-90校2庙型定时恒温旦磁力搅拌器党Micro祥fuge醒Lite罪沟离心机惹THZ-C弊染恒温震荡器伟Bio-R蚀AD100督0存/屋500蹲型电泳仪再ZF-4泡型紫外透射鬼反射分析仪厅LIBRO吹RHEL仪-200萄型电子天平写UV-26照5言风光光度溜计，顷Shima严duzu沟QL-90炉1爪型旋涡混魄合洽YJ-87汗5因医用净化姓工作台议DT-BI尼型脱色摇束床拔Milli娘-Q沈型纯水器爬HW-8B很型恒温器况松下砌NN-K5属63S方微波炉实验方法滋一、大量诱逆导表达目的开蛋白昂[42]择1衔、悬将重组工程你菌M15/翅pQE31毫hexon蹦接种在含氨始苄（100盘ug/ml兔）和卡那（丙50ug/浊ml）的培巴养基中培养漆，同时设空杯白菌M15附作对照，过朋夜培养。划2辈、殖将菌液按1煮：50的比拉例转接到8吨00珠ml做LB培养基气中，当菌液常的OD趴600困值达到0.筐5时，加入圾IPTG(滥诱导剂)至捞终浓度为1奖mM进行诱障导，37情℃虑，150转等/分钟，培户养4小时，证离心，60编00帝rpm膏，宗10min炊，收集沉淀开。同时取不君加诱导剂的返菌液作对照倍。还3远、宗加入2单×躲SDS上样缴缓冲液，煮答沸5分钟，芦进行SDS祸竟电泳，检测蕉蛋白表达情粒况。挨二、六邻体己蛋白的纯化捧（一）裂解场细菌阿1但、统加入12吐mlBu叶ffer璃B恶，充分混匀岸，裂解细菌开，1赤h另；汽2则、夕辅助超声，烤工作10丙s榜，停10追s以，功率40惧0钻w，众工作次数2慌0；迈3元、面溶液澄清后希，离心，1港2000泳rpm求，模25min宿；趋4姻、歼收集上清液素，以备纯化垮；尊（二）大量怠纯化目的蛋驾白界1、逃加3.2处ml鹿50%吗Ni-NT袜A暑的混合物偶于12曲ml独裂解液，室慰温下摇床振论荡60破min雾；妥将裂解液-鲜树脂混合物辣移入空的柱谁子；困移去尾端帽俗，收集流出轰液垫；穷2、尽用8物mlBu恩ffer废C伪洗去未结合两Ni-NT冬A遣的蛋白；规3、靠用8询mlBu葡ffer旱D忠洗脱目的蛋石白；够4、幼用4舟mlBu笔ffer弯E揭洗脱目的蛋时白；舰三、蛋白定附量煤箱Bradf皱ord法锹[43]对1渗、妻标准蛋白质痒溶液：用P斥BS配制结梨晶牛血清清倦蛋白（BS茂A）成10扶mg/ml避的标准蛋白侮溶液。果2辱、埋标准曲线的书测定：取7滥个EP管以帖10mg/泥ml的BS纹A为母液分傲别配制0，录0.1，0盘.25，0瞒.5，0.举75，1.挤0，1.5往mg/ml鸡的标准蛋白眨质溶液；另及取7个EP若管每管中加烧入300住μ物l汗考马斯亮蓝正G-250你试剂，并在梳各管分别加守入以上浓度刻的标准蛋白开质溶液5意μ桂l碎，在室温（悬20~25乒˚墙C）下放置吗5-15m代in，通过掌蛋白质－核赶酸微量检测刊仪检测。用眼标准蛋白质帮量（mg）剃为横座标，纸用吸光度值和A595为婶纵座标，作申图，即得到稠一条标准曲曾线。由此标通准曲线，根支据测出的未秩知样品的A蹄595值，吵即可查出未爽知样品的蛋近白质含量。率用未加蛋白窄质溶液的第摇一支试管液竖作为空白对降照液.梅3驶、涂样品的测定再：用上述同巨样的方法，训测定未知样穿品的蛋白质宪浓度。顺四、动物免贫疫辫1患、且初次免疫伤将500u光g纯化的重惊组人腺病毒借六邻体亚基砌蛋白与完全揭弗氏佐剂等植体积混合，拖碾磨至油包绒水状麻[44]计。背部皮下旨注射新西兰华家兔，观察场记录家兔的陆状态变化.壳2讨、售2周耳缘静亡脉进行采血顿，离心分离科血清,分装如保存至-2喷0度冰箱中馋.腹3惩、雄加强免疫剪第3周，以事减半量(2胸50ug)具纯化的重组夹人腺病毒六涂邻体蛋白与识不完全弗氏诞佐剂等体积栋混合,采用竹通过注射入惕腹腔的方法撑进行加强免涂疫。观察记雨录家兔的状糖态变化.膨4耽、狭第4周耳缘鞋静脉采血，茫离心分离血屿清,分装保烂存至-20短度冰箱中。译检测抗体效栗价。根据血雾清效价决定挺大量采血，骡第6周心脏乌采血，离心雹分离血清,僻分装保存至悲-20度冰舞箱中。盒五．重组蛋启白抗原性鉴歪定（wes铲tern-禽blot）朽：孟（一）抗原赖性鉴定恋1、捎安装玻璃板期2、睁配制12％查的分离胶溶南液，依次混孙合各成分。素1锣5盾%SD患S-PAG完E尼分离胶体武量考10ml亦躁ddH宾2绸O维动浅掠律搭3牺.3优ml智使30%丙烯途酰胺溶液与来顺4.0砌ml皆吧1.5浆mol/L涌Tri太s-cl(谎pH8.0汉)寒而2.5m弱l夸意10%SD曾S坦衫0.1m据l占严10%签过硫酸铵需处0.1召ml远梦枪TEMED朗它叉堡苗凳董仍0.004械菊ml碌一旦加入T喜EMED，区马上开始聚贵合，故应立及即快速旋动剑混和物并进担入下步操作驶。劝3、曲.速在两玻政璃板的间隙毙中灌注分离莫胶溶液，留钞出灌注积层悬胶的空间（辟梳子的尺长耳再加一厘米岸）。用吸管捞小心的在分妻离胶溶液上绣盖一层异丁助醇。将凝胶东垂直放于室启温。蒜4、括分离胶聚合生完全后（3钻0min）傅，清出覆盖厚液体，用去臭离子水洗涤徐凝胶顶部数申次以除去未元聚合的丙稀岩酰胺。尽可材能除去凝胶集上的液体，拌再用纸巾的史边缘吸净残镜留的液体。遗5、倒配制5％积废层胶溶液，远依次混合各柱成分。嘱5%SD奸S-PAG解E积层胶药绸桌饥3ml中ddH拾2旬O燥秧发2.1缘ml华勾30%丙烯豪酰胺溶液高飘虚0.5饲ml储迹10%SD袄S汉盒0.03方ml枕帖1.0绝mol/骨LTri跨s-cl(低pH前6.8仅)胀扣脂0.38你ml哄亿10%勉过硫酸铵克未0.03仰ml鄙分TEME脊D素耍捆逃乔风文0.0仿03旅ml翻一旦加入T坊EMED，梳马上开始聚所合，故应快侧速旋动混合璃物并进入下悔步操作。窃6、敲在已经聚合螺的分离胶上揭直接灌注积识层胶，立即翅在积层胶溶划液中插入干嫌净的梳子。优小心避免混闭入气泡，将瓶凝胶垂直的撑放于室温下芽。阔7、舰积层胶发生黎聚合时，可挨以在样品中策加入2透×显SDS凝胶扰加样缓冲液塔，在100味℃溜加热10分狸钟，使蛋白移质变性。魔8、送积层胶聚合森完全后（3奖0分钟），川小心移出梳物子，立即用棋去离子水洗德涤加样槽以荒除去未聚合誉的丙稀酰胺秧。哪9称、叉按顺序加样乞，每加完一不个样品后在休下槽缓冲液俊中洗涤加样眼注射器。最耽后在所有不检用的样品孔冻中加入等体榴积的2已×尖SDS凝胶痰加样缓冲液糖。它10、豪将电泳装置太与电源连接蜡（正极应接倘下槽），凝螺胶上所加电苗压为8V/列cm。当染豆料前沿进入良分离胶后，苦把电压提高怠到15V/授cm,继刮续电泳直至治溴酚蓝达到征底部，然后梁关闭电源。浑11、票从电泳装置相上卸下玻璃世板，用刮勺鄙翘开玻璃板侧，将胶取下滩。杀12、撕经SDS-拾PAGE电跪泳后，将凝标胶与6层滤拦纸、NC膜磁浸泡于转膜命缓冲液中，锤15分钟。玩13、传修剪膜与滤和纸使其与凝死胶大小相等伯，半干转印稠45分钟。跃14、慧转印后取膜敬置于5%脱朝脂奶粉中，缓4统o届C过夜。跨15、堵加入一抗：完以封闭液1学：2000断稀释兔血清阅为一抗，将穴膜浸泡于其裳中盖上盒盖却，37畏o棋C缓慢摇动靠，1小时。萍16、固漂洗：以P惰BS（PH丈7.4）清症洗NC膜1忌5分钟3钞次。酿17、预加入二抗：抛以封闭液1纳：5000樱稀释辣根过配氧化物酶标聪记的二抗，骆将膜浸泡于愈其中盖上盒容盖，37康o奥C缓慢摇动肿，1小时。暴18、劳漂洗：以P缓BS（PH死7.4）清录洗NC膜1负5分钟3破次。躲19、垒显色：DA叨B显色，在建4mlSo及lutio绑nB中，棚滴入4ml及Solut谅ionA科清清摇动，相将NC膜浸慰入其中，观点察2-10限分钟，终止尾显色，照相述。动（二）抗体报效价检测俗进行SDS错奉后，将兔血闷清一抗从1续：1000秩开始按倍比尽稀释，直到细检测不到特菠异性条带,奖进行免疫印颠迹试验，结请果照相保存核。炎六铃、竹特异性鉴定伴按上述方法飞以1：10孙000倍灿稀释的兔蛋止白血清为一湖抗与重组蛋乱白、BSA进蛋白、3型惧腺病毒、柯后萨奇病毒、挨E.col疗i功M15菌株织和细胞进行萄Weste彻rn-Bl备ot检测，另结果照相保旺存。钳七释、懒体外保护试班验：梳（一）腺病国毒毒力测定条－TCID瓣50臣1国、扶细胞培养菠（1）毙选生长良好先的妹HeLa细靠胞，轻轻摇便动培养瓶数盼次，悬浮起凑浮着在细胞也表面的碎片炒，然后连同炎生长液一起灿倒出。咱（2）授从无细胞单区层的瓶壁侧吹加入0.0魄2%EDT典A消化液4瞧～5mL，域翻转培养瓶前，使消化液漂浸没细胞。丽（3）确放入37绘o主C励二氧化碳孵链箱5～10垄分钟，为错促进细胞的挥消化，可以蜡加入37蒜o章C析预热的消化鞭液，在显微剂镜下观察，虾发现细胞回洒缩、细胞间肃隙增大后，币应立即停止腾消化。披（4）靠倒出消化液趋，沿细胞面嚷加入适量的沃生长液，用玩吸管反复吹目打瓶壁细胞愁，使细胞分沉散开，按1慰传2或1传记3进行传代夏培养。充（5）林粉37看o喜C望二氧化碳孵诚箱培养，接仪种后30分遵钟左右可贴冬壁，48小警时更换生长好液，一般3毙～4天可形鸣成单层，形狠成单层后再帽换维持液供挣实验用。就2、寺病毒接种俭倒掉细胞培妥养液，将腺勒病毒悬液以顽１０倍比例滥进行倍比稀剖释至10挑-9渴,每孔20旧0ul，3士7顿o煤C潮吸附1.5述小时，弃上眯清，各瓶中史换3mL含盲2%胎牛血益清的细胞维厌持液，在3厉7棋o腹C按二氧化碳孵连箱中常规培著养。疮3、杜观察细胞病菜变积每隔12小窜时用普通光代学显微镜观忽察细胞病变齐（CPE）屋情况。当5托0%细胞出管现病变时，虹视为CPE章阳性细胞，俘收集细胞，栽对72小时钥未出现细胞名病变的窜接种细胞，某视为CPE寇阴性细胞。伴同时，设定己正常较HeLa院细胞为阴性厚对照，以接没种相应病毒猫标准株的截HeLa魔细胞为阳性失对照。按照肚Reed-慢Muenc路h方法计算穴TCID磨50驻[45]享。薄(二)轰中和试验（刘固定病毒-传稀释血清法头）后寸本试验盆用于鉴定爹兔历血清中是否威含有抗晒腺病毒头的中和抗体膝。岗试验准备胳1迟、缘Hela按细胞培养于离96孔微量疤细胞培养板奥上。津2因、广病毒盲腺病毒悬液刮，使用前用蚁2%RPM赖I1640辟细胞维持液奔液稀释至兔200助TCID婆50与/0.1m陷L。唉3靠、算血清待席检血清和正爆常血清（阴挡性血清）用报等量的优2%RPM佣I164繁0骑液（每毫升鱼含青霉素2财00IU、惩链霉素20彻0mg）稀镰释后，于4清5腹℃巨灭活30m燥in，待冷悉却后使用。博职筐操作步骤垦宅满1朽、酷将已灭活处帆理的待检血睁清，用扣2%RPM磨I164挡0细胞维持诞液作系列倍芬比稀释，使障其胃血清筐稀释度由1仪∶液50崇到1剥∶堤12800恢.劲骂桐2篇、挠分别在上述窃各管中加入病等量赚的础100犹TCID专50汤的湖腺病毒加悬液，充分锐摇匀混合。活薯3督、豪于3随7尾℃副温育60m廊in。炕芳4绍、汪取出后分别炮接种于长满题Hela真细胞单层的嚷96孔微量敞细胞培养板跳，每个稀释瓶度窄4嚷孔，每孔0织.1mL。鸟雁号5歪、录按上述步骤桑设立正常血庄清对照；将禽腺病毒柄悬液连续1卧0倍稀释后绵（10枣-1今～10拨-7累）接种上述砌培养板，每瓶稀释度4孔关，每孔0.懂1mL，作蚁病毒悬液毒已力滴度对照书；96孔微克量细胞培养般板H排12包孔作为正常欧细胞对照。含荐隔6畜、负各孔加入细跨胞维持液至岁总量0.2莫mL。层莫7府、炒放入炭37祥℃批培养箱培养询，逐日观察宋病变，记录朗结果（按表嘉3填写）。结果掏一滑、闻Hexon饲L1瘦、幅L2秤蛋白的诱导普表达：竖将重组工程轮菌踪M15苍/欣pQE31意hexon向与空白对照够菌毁M15誓培养后加入寻IPTG标诱导表达4粱h。用1婚2%的分离傻胶进行笛SDS-P忠AGE栗电泳分析，宅电泳结果表晒明在相对分箭子质量(摔M廊r弊)约为52允×谜10霞3溜处可见一目叶的条带，与彩预期结果相隐符，见图3宏。广滚平M斧r览（旬×呼10缝3内）狸箱M1页2练394.067.094.067.043.030.020.114.4离图3六邻与体蛋白的诱嚷导表达犯Figur芦e3敲expre绸ssion叙ofp抓rotei挺nhex元on肺M:mar躺ker港1:M1迫52:仪unind章uced齿3:in割duced粥ure0面二洪、挺纯化结果：概经群Ni-NT促A晚柱大量纯化裙后，用12盖%的分离胶棉进行果SDS-P我AGE件电泳分析，馅电泳结果表暖明在相对分凡子质量约为刑52布×终10样3首处可见一目锈的条带，且拘纯化效果理踩想。结果见芹图4、5。他M叮r（徒×盈10异3棕）94.067.043.030.020.114.4冰衡泳M刑正1治23觉残振494.067.043.030.020.114.4熟渡膨图4蛋迁白大量纯化促（一）亚肌Fig罗ure绑切4章Lar宪gely扭Puri公fying天Hex滋onP换rotei候n燃M驼：渣marke餐r1鼠：鬼unind古uced旷2公：熄induc克ed3蔬：简wash悼14露：烂wash酬4取扇没5遍：倡wash近8陈6科：千elute养13卧7很：誉elut呜e16伍M剧r龙（伐×鞭10韵3欠）痕M攀踢12果3宾事45劈6脑794.067.094.067.043.030.020.1桑图5蛋廉白大量纯化斧（二）天Fig肠ure伸摇5玩Larg慈ely坑Purif贵ying短Hexo切nPr寿otein窗勤辈M伞：mark陷er1饱：elut辉e19病2：el道ute2削13：姿elute吉23拿识4：el镰ute2动65：柜elute吧29.仪.6：e恶lute捞327缺：elut暮e35丝埋三危、闹蛋白定量差安通过考马斯惩亮蓝法（B编radfo铅rd法），催绘制标准曲泽线，来初步扮判定纯化的屡六邻体蛋白令的含量。结陷果见表1事表1.妈蛋白纯化标拣准曲线减table抬1.秤stan络dard黄curve军ofp斩urifi签edpr斜otein略粱重组六邻体端蛋白C=1川20ug/斑ml艰四谦、块重组蛋白抗芝原性检测坟（一）抗原耍性检测摸用纯化的重乎组六邻体蛋欧白免疫毙兔子六周后得采血收集血啦清，用醋Weste炕rnbl荣ot加对血清进行款检测，结果双表明该血清久与重组蛋白咱能够进行特运异性反应，况沸在邻M波r蹲52欠×搁10引3质雁处出现特异打的显色条带勉。说明该重霉组蛋白具有垫良好的免疫捆原性和反应垃原性，即具恭有良好的抗偶原性。盲机倦糕M1234便产医滩驴M1234鹊怎M寨r墨（翼×陪10槽3禽）52kd52kd坟图6重组蚕蛋白免疫原筑性鉴定帽Fig6亏iden仇tific动tion坏of筛immun涌ogeni运city壁蒸M讽：池prest武ain僻marke搜r雹,1:E.鄙coli敬M15,森2榆：抄unind丸uced挑研M15pQ封E31he筛xon还,蚀3改：颠induc凭ed处M15pQ输E31he忘xon版,去4愿：德Hela比Cell设码迫（二）抗体豆效价的检测糊将抗六邻体注蛋白兔血清诊一抗按倍比丹稀释法从1仪:1000岗稀释至1:泳1024蚂000，速与六邻体蛋赢白重组工程虑菌进行We涌stern搁-Blot三检测，结果视表明该血清梅被稀释至1掩:102男4000许后仍然能够移与抗原发生穗特异性结合戒（如图7顽），说明该腰抗体效价极可高，稀释百患万倍后，仍酸然可以与抗胳原发生反应网。够M1韵2铅34岸56赚7竟89饶101群112堆1352kd口指姥兔52kd功图7抗体照效价检测扁Fig7东anti忙body般titer哥test独绣智附Mpr坚ostai休nmak烈er1.丰Ecoli倒M15,袍2.抛unind弱uced殖足M15pQ伴E31he洽xon怕,武坊3-13：楚induc耍ed读卖M15pQ唉E31he晋xon冠dete仅cted余with反dilut穴edan鹅tiser茎afro弹m基1:100页0(lan看e3)吩to1：委1024岔000(浩lane概13)沃五黎、季抗六邻体永蛋白血清的苍特异性鉴定胁肯用1：10祸000倍央稀释的兔蛋少白血清与重筋组蛋白、B私SA蛋白、田3型腺病毒煎、柯萨奇病竭毒、跟E.col详i羞M15菌株射和细胞进行丰Weste姑rn-Bl封ot检测，贝结果该血清哥只与良重组工程菌侍E.col伍i朱M15士/路pQE31去hexon进菌株和3型雀腺病毒发生投特异性反应谷，而不与E刮.coli违康M15剪菌株、BS线A蛋白、柯发萨奇病毒以璃及Hela估细胞反应(起图8)。搭123M456箩厦车M兰r滥（拴×权10虽3细）123M456120KD52KD扰踏劫狠候120KD52KD刘图8重组警六邻体蛋白栗特异性鉴定饱Fig8指死speci佳ficit经y英iden环tific句tion锋of丛recom响binan街th洽exon偷1:in校duced洗雨M15pQ触E31he馅xon牵,辽2筋：受unind徒uced秀犹M15pQ皂E31he促xon准,伴3种：授induc膨ed浙M15.缝M:pr扎estai检n杏marke剂r柜,4匠：光BSA,5伪：腾Adeno领virus喉,6:c足oxsac辉kievi中rus咳六育、中体外中和实羡验桶：贱（固定病毒丢-稀释血清凝法）丙（一）腺病辽毒TCID蒸50叼的测定:喇每隔12小阴时用普通光脾学显微镜观展察细胞病变宇（CPE）封情况,与正华常细胞(细腰胞呈梭形)很组相比，腺唉病毒感染的谅hela细比胞变圆，细轮胞彼此相连胞呈典型的葡兰萄串样改变祖。当50%嘴细胞出现病逆变时，视为济CPE阳性敢细胞，对7妄2小时未出旅现细胞病变控的柄接种细胞，描视为CPE法阴性细胞。疾病毒稀释度击出现CPE狸数川累积CPE董数谅未出现CP傻E数黑CPE比例婶百分率潜10口-3肝4/4蜓9妈0捐9/9遗100早10糊-4冠3/4湾5桌1画5/6羡83申10厘-5施2/4即2棍3炭2/5哪10拥10荣-6行0土0培7华0/11军0辜表2腺病毒处TCID蚊50绍的测定结果亿table练2TC注ID纸50狱ofa店denov汤irus坚1．计算各势病毒稀释度押阳性孔数目术（1）和阴郑性孔数目（宣2）鞭2．计算阳辉性和阴性孔查的累积数孝阳性孔累计拴数由下向上租累积（3）射；阴性孔累治积由上向下郑累积（4）贺3．计算阳的性孔的百分建比：比率（农5）=（3验）/[(3骆)+（4）弦]；钳(6)=（溜5）×10牧0眠4．计算距震离比铁距离比例=筋（大于50坝%的阳性百袖分比-50嚼）/（大于胁50%的阳贫性比-小于猎50%的阳秃性百分比）结=（宽83－晌50）/（演83－4阳0）=夏0.7回TCID惑50婆的对数=大毒于50%的丢阳性百分比梁的最高稀释隙对数+距离钥比例x稀释逢系数的对数个赤皱

=蕉4燕+0.莫7嗓×猛1土=品4.7宇TCID受50铁=10万-许4.7欠/100惹ul任串反矿=（83-抛50）/(呆83-40艳)=0.7晴TCID5来0=10弱-4.7宜ml领10齐-2.7粥病毒悬液有世100TC姻ID50.庭（二）中和历实验结果现经过观察，厦在48小时坑后，空白对晴照孔和阴性眨血清对照孔绿细胞出现病馅变，细胞变长圆,呈典型监的葡萄串样窃,正常细胞扔孔内hel倒a细胞呈正份常生长状态辞。实验组从靠1：50到旧1：800颠稀释度he绍la细胞呈嚼正常生长状羊态。1：1间600组有真3孔发生C诊PE，至1阶：3200泽稀释度细胞笋全部发生C天PE.血蛋清中和抗体挖效价即能保院护50％的联细胞培养孔绳不产生病变抹的最高血清摆稀释度，本寸实验中血清闲中和抗体效衣价为1：8深00。皇空白对照学正常对照腐1：50猾1：100评1：200泰1：400窜1：800兆1：160佣0贵1：320届0取1：640窄0拐1：128淘00昏阴性血清谅1朴+译+喉+蚊+桶+贴+逗2筹+抽+饮+院+拳+汁+景3饼+沸+铃+殃+猜+造4久+忌+斯+辫+妈+誓+蜘表3中和实临验结果烟table悄3.ne粮utral袍izati皆onte喉st斧讨躬论茎腺病毒的感揪染十分普遍崖，引起多种丽疾病，是儿恰童呼吸道感李染的主要病改原之一闭[10-1妨2],熟有的型别尽的腺病毒还伸会引起细胞策转化，甚至役致癌勉［13］赞。目前尚没倚有十分有效光的预防措施何，因而，腺不病毒基因工油程疫苗的研暴制和开发有杏着广阔的前械景。A戚d菊v动拥六邻体是腺闪病毒的主要握抗原蛋白兄,屯刺激机体产突生抗体，抑粮制病毒构象身的改变，从援而中和病毒畅体。闲本实验组构号建了腺病毒籍六邻体的L住1,L2区径[46]琴，这些区域思位于在六邻狐体的三维结狸构图上位于钥三角形顶端崇(L1,更L2)