微生物的培养技术及应用第2课时课件【知识 精讲精研 】 高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节微生物的培养技术及应用（二）本节聚焦:怎样应用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理？如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物？测定微生物数量的常用方法有哪些？选择性必修3/第1章/发酵工程/自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。稀释涂布平板法呈现的杂菌群该怎么办呢？选择培养基应运而生。二、微生物的选择培养和计数1.选择培养基二、微生物的选择培养和计数1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。【思考】为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。

实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。【思考】如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？聚合酶链式反应PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和PH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。1.选择培养基二、微生物的选择培养和计数概念：原理：【思考】怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照。若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。耐热微生物耐寒微生物石油分解菌1.选择培养基二、微生物的选择培养和计数类型：①利用添加某种化学物质进行选择培养加入青霉素的培养基分离酵母菌、霉菌等真菌（青霉素能杀死细菌、放线菌,对真菌不起作用）加入高浓度食盐的培养基分离金黄色葡萄球菌②利用改变培养条件进行选择培养70～80℃的高温分离耐高温的水生栖热菌使用将PH调至酸性的培养基分离耐酸菌无氧环境下培养分离厌氧型和兼性厌氧型微生物1.选择培养基二、微生物的选择培养和计数类型：③利用营养缺陷进行选择培养不加氮源的无氮培养基分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物石油是唯一碳源的培养基筛选出石油降解菌如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？选择培养基配方的设计

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素不能直接被农作物吸收，土壤中的细菌将尿素分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。土壤中的细菌分解尿素是因为他们能合成脲酶。CO(NH2)2

2NH3+H2O+CO2

脲酶讨论1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？讨论2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。2.微生物的选择培养二、微生物的选择培养和计数1g土壤中有多少能分解尿素的细菌?稀释涂布平板法(2)两个基本操作：(1)概念：是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养的方法。稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。梯度稀释和涂布平板操作过程2.微生物的选择培养二、微生物的选择培养和计数①铲取土样，将样品装入纸袋中。90mL无菌水9mL无菌水②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。梯度稀释:操作过程2.微生物的选择培养二、微生物的选择培养和计数涂布平板:③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。操作过程2.微生物的选择培养二、微生物的选择培养和计数培养与观察:待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d。3.微生物的数量测定二、微生物的选择培养和计数显微镜直接计数（直接计数法）(1)原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数(2)优点：(3)缺点：不能区分死菌与活菌计数结果偏大快速、直观3.微生物的数量测定二、微生物的选择培养和计数稀释涂布平板法（间接计数法）除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。(1)作用：(2)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。3.微生物的数量测定二、微生物的选择培养和计数稀释涂布平板法（间接计数法）④因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数表示。⑤分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。(3)注意事项：①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。因此恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。②为增强实验说服力与准确性，设计实验时，在同一稀释度下，需要涂布至少三个平板作为重复组（重复实验，减少误差）。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低（因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落）。每g样品中的菌落数＝(C÷V)×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M代表稀释倍数。3.微生物的数量测定二、微生物的选择培养和计数稀释涂布平板法（间接计数法）(4)计算公式：

需要。主要目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。【思考】需要设置对照实验吗？若需要，目的是什么？换算为一个大方格（0.lmm³）稀释液中的菌株数显微镜直接计数法稀释涂布平板法主要用具显微镜、血细胞计数板培养基计数依据菌株本身培养基上的菌落数优点计数方便、操作简单计数的都是活菌缺点死菌活菌都计算在内操作复杂，有一定误差结果比实际偏大比实际偏小计算公式1ml原液含菌株数=每小格平均菌株数*400*10*1000*稀释倍数lml原液含菌株数=平均菌落数/涂布平板所用稀释液体积（ml）x稀释倍数直接计数与稀释涂布平板法的比较换算1mm3稀释液中的菌株数换算1ml稀释液中的菌株数换算1ml原液中的菌株数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？提出问题：作出假设：平板划线法和稀释涂布平板法稀释涂布平板法或显微镜直接计数法绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。组分含量KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4•7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0gH2O定容至1000mL选择培养基的配方土壤中分解尿素的细菌的分离和计数实验设计：(1)土壤取样:①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。②取样过程：铲去表层土3cm左右(分布在距地表3～8cm的土壤层)。①细菌：一般用104、105、106稀释液。②放线菌：一般用103、104、105稀释液。③真菌：一般用102、103、104稀释液。(2)样品的稀释与涂布平板由于初次实验，不知稀释的范围，可选择一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。设置4组样品，每个稀释倍数下3个选择培养基作为实验组，1个牛肉膏蛋白胨培养基，作为对照组。以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数实验设计：【思考】怎么设置对照说明培养基发挥了选择功能？【思考】怎么设置对照说明菌落数是有效的？将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目。在适当的稀释度下实验组有至少2平板的菌落数在30～300之间。(2)样品的稀释与涂布平板实验组对照组土壤中分解尿素的细菌的分离和计数实验设计：(3)微生物的培养与观察不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。①培养条件：②观察：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数操作提示：第一天：进行实验器材的灭菌、制备培养基及倒平板的工作；第二天：进行稀释涂布平板的操作；第三、四、五天：进行实验结果的观察与记录。取土样的小铁铲、盛土样的信封、培养皿、培养基、试管等在使用前都需要灭菌；应在火焰旁盛取土壤，并在火焰附件将土样放入锥形瓶中，塞好棉塞；在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作；在涂布平板时，要灼烧涂布器并在火焰旁操作。(2)实验过程中，要注意无菌操作：(3)由于该实验耗时较长，要事先规划好时间：(1)将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复）；4为牛肉膏蛋白胨培养基（对照组，用以判断选择培养基是否具有选择作用）；整个实验还要设置2个平板：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌(空白对照)。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数操作提示：(4)每个浓度至少设置4个平板：实验组对照组1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数结果分析与评价：3.你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？土壤中分解尿素的细菌的分离和计数结果分析与评价：若选取同一种土样，统计结果应该相近；若结果相差太远，则需要从各项操作过程中去分析、寻找可能的原因。练习与应用一、概念检测1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。（1）这种培养基是一种选择培养基。（）（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（）（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（）

√√√练习与应用一、概念检测

2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（

）A.菌落中的细菌数目是固定的B.平板上的一个菌落就是一个细菌C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌D练习与应用二、拓展应用

1.反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。1.